ZHJ-MAPCs的细胞学初步分析鉴定及共培养诱导向肝样细胞分化研究

摘要

治疗终末期肝病最有效的方法之一就是原位肝移植(orthotopiclivertransplantation，OLT)，然而，由于供体的缺乏、免疫排斥和高额费用等问题，OLT的广泛应用受到了限制。肝细胞移植(hepatocytestransplantationHCT)经过近30年的发展，正由动物实验向临床过渡，初步结果显示，肝细胞移植在急慢性肝衰竭和遗传代谢性肝病方面具有很好的应用前景，但同样面临肝细胞来源有限，排斥反应等问题的困扰。杂交型生物人工肝(Hybridbioartificialliver,HBAL)治疗可以使终末期肝病病人桥接(bridge)肝移植，而且由于肝细胞具有强大的再生能力，临时应用生物人工肝也可以暂时代偿肝功能，促进肝细胞再生，部分患者肝功能完全恢复正常。但作为HBAL核心生物材料的肝细胞来源问题未得到根本解决，使HBAL的临床应用远未达到理论上的预期效果。研究证明人骨髓来源的多能成体祖细胞(Multipotentadultprogenitorcellsfrombonemarrow，MAPCs)具有向肝样细胞分化的潜能，由于其具有易于增殖、调控、供源丰富、容易获取、有自体供源避免免疫排斥等优点，有望成为理想的组织工程细胞来源。本课题组前期实验通过密度梯度离心—贴壁培养筛选—免疫磁性双阴性分选(magneticactivatedcellsorting，MACS)三个步骤高效率地纯化分选出骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)亚群MAPCs(CD45-，GlyA-)，并将之命名为ZHJ-MAPCs(Zhujiang-MAPCs)。通过改良细胞培养基等方法，我们建立了ZHJ-MAPCs的传代培养技术(结果尚未发表)。 第一部分：ZHJ-MAPCs特征表型及细胞遗传学初步分析鉴定目的对经过CD45、GlyA免疫微磁珠体外负分选纯化并传代培养的ZHJ-MAPCs进行体外部分细胞学鉴定，了解其特异性标志物表达及增殖、传代过程中的遗传学稳定性。 方法(1)取原代冻存的经过CD45、GlyA免疫微磁珠体外负分选纯化的人ZHJ-MAPCs复苏培养，传代后进行CD29、CD44、CD34和HLA-DR流式细胞分析，初步了解ZHJ-MAPCs特异性表型的表达情况。(2)分别在传至第6代和第13代时进行细胞核型分析了解细胞核型变化。 结果(1)流式细胞仪检测ZHJ-MAPCs中CD29阳性表达细胞比率为99.2％，CD44阳性细胞比率为98.3％，CD34阳性细胞比率为1.2％，HLA-DR阳性细胞比率为5.3％。(2)ZHJ-MAPCs在增殖传代过程中表现出非正常二倍体特征，染色体干系数目在第6、13代均为55～58条，占80％，染色体数介于超二倍体和亚三倍体之间，镜下见细胞均发生染色体变异，且变异形态多样。 结论(1)ZHJ-MAPCs具有骨髓间充质干细胞的特征及较高的纯度。(2)ZHJ-MAPCs在增殖传代过程中表现出非正常二倍体特征，染色体数介于超二倍体和亚三倍体之间，染色体变异形态多样。 第二部分：ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02体外共培养向肝样细胞分化的实验研究目的探索人骨髓来源ZHJ-MAPCs在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。 方法(1)间接共培养：将分别接种于盖玻片上的第4代ZHJ-MAPCs和人肝细胞系L02(密度均为1×105/ml)按照各50％比例共置于直径10cm培养皿中，培养液共通，实现间接共培养。分别于间接共培养第1、3、5、7天免疫细胞化学鉴定ZHJ-MAPCs的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝细胞特征性表型表达变化情况，并设阳性对照(单独培养的L02细胞)和阴性对照(单独培养未经诱导的ZHJ-MAPCs)，计数阳性细胞比率；(2)直接共培养：将CFSE荧光(绿色)标记的第4代ZHJ-MAPCs与L02(密度均为1×104/ml)按照各50％比例混合后接种于激光共聚焦显微镜检查专用培养皿内，实现直接共培养。5天后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察ZHJ-MAPCs表达ALB、AFP、CK-18的情况。同样设阳性对照(单独培养的CFSE标记L02细胞)和阴性对照(单独培养的CFSE标记ZHJ-MAPCs)。 结果(1)间接共培养结果：AFP作为不成熟肝细胞的表型标志，间接共培养诱导的ZHJ-MAPCs在间接共培养第1天表现为强阳性表达，随后表达逐渐减弱，至第7天，AFP的阳性表达已经很少。而ALB在第1天有可疑阳性表达，间接共培养第3天，ALB即出现较强的阳性表达，第5天，ALB的阳性表达既达到高峰，第7天，密集生长的细胞仍广泛的阳性表达ALB。间接共培养第1、3天检测CK-18均为阴性，至第5天CK-18开始出现阳性表达，第7天CK-18阳性表达较前增强。CK-19在各时间点均为阴性着色。阳性对照细胞ALB及CK18有较强的阳性表达，AFP弱阳性表达，CK19阴性表达。阴性对照细胞均为阴性表达。(2)直接共培养结果：CFSE荧光标记的ZHJ-MAPCs和L02直接共培养，在第5天行SABC-Cy3免疫荧光染色后行激光共聚焦显微镜扫描，结果镜下表达黄色荧光的细胞即是向肝细胞分化的ZHJ-MAPCs，为阳性细胞；单纯表达绿色荧光的细胞为未分化的ZHJ-MAPCs；单纯表达红色荧光的细胞为L02细胞。结果ALB和CK18检测时，较多细胞胞浆内出现黄色荧光表达，而AFP阳性荧光表达则仅出现在极个别细胞浆内，该结果与阳性对照细胞荧光表达类似，而阴性对照细胞未见有阳性荧光表达。 结论(1)与人肝细胞系L02间接共培养能够诱导人骨髓来源的ZHJ-MAPCs向成熟肝样细胞定向分化。(2)与人肝细胞系L02直接共培养能够诱导人骨髓来源的ZHJ-MAPCs向成熟肝样细胞定向分化，且时间有提前趋势。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分ZHJ-MAPCs特征表型及细胞遗传学初步分析鉴定

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分ZHJ-MAPCs与人肝细胞系LO2体外共培养向肝样细胞分化的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

缩略词表

文献综述 生物反应器中细胞模块的研究进展

附图

致谢

发表论文情况

学位论文原创性声明及版权使用授权书