双功能分子BHL-I、IL-2/GM-CSF对人外周血淋巴细胞增殖、活化及功能的调节作用

摘要

背景和目的： 1975年Kohler和Milstein发明了制备单克隆抗体(MonoclonalAntibody,McAb)技术后，单克隆抗体迅速在临床治疗与诊断上发挥了巨大的作用。但使用单抗常会诱导人抗抗体产生；体内注射的单抗被血循环中的游离抗原等所中和，使达到治疗部位单抗量较少；更重要是完整单抗由于其Fc段与体内很多细胞表面的Fc受体结合而诱发多种毒副作用，使单抗的特异性大为降低。同时完整单抗对实体瘤穿透力较差等限制了单抗在临床上的应用。而由抗体分子中VL(轻链可变区)和VH(重链可变区)构成的单链抗体(singlechainFv，scFv)的出现，由于scFv在体内免疫原性弱、没有Fc段、对肿瘤组织浸透能力强等特点，使人们对用抗体分子来治疗肿瘤寄予了新的希望。 将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体(如CD3抗体、CD16抗体)联结在一起，则为双功能抗体(bifunctionalantibody)或称双特异性抗体(bispecificantibody，BsAb)。BsAb可使免疫效应细胞更易与靶瘤细胞识别结合，从而促进效应细胞对靶瘤细胞的细胞毒作用。 抗人卵巢癌/抗人CD3双特异性单链抗体(BHL-I)是通过基因工程手段生产，能与相应抗原特异性结合的双功能单链抗体分子。BHL-I在体外介导的效靶细胞结合、效应细胞(PBL)增殖及对靶细胞的细胞毒活性进行了研究，同时了检测PBL细胞毒作用过程中细胞因子的变化，BHL-I于裸鼠体内介导PBL细胞毒的情况；对另一双功能分子(Bifunctionalmolecule，BFM)---细胞因子融合蛋白IL-2/GM-CSF介导PBL与髓性白血病细胞株THL-1结合、增殖活化PBL以及诱导PBL对THP-1的细胞毒作用等方面来研究。以探讨BHL-I体内外、IL-2/GM-CSF体外对PBL生物学活性的影响及其介导PBL细胞毒效应的相应机制，为BHL-I的进一步实验与临床应用提供实验数据；为IL-2/GM-CSF的将来的临床前实验和临床应用提供实验依据。同时也为研究双功能分子体内外生物学活性建立了一些可借鉴技术。 方法： 光镜下计数BHL-I介导PBL与SKOV3间的花环形成及百个SKOV3上的淋巴细胞结合数(结合率)，以单链抗体(a-CD3，a-SKOV3)和它们的联合使用为对照；以同样方法检测了IL-2/GM-CSF介导PBL与膜上表达有GM-CSF受体的白血病细胞株THP-1间的结合情况。 在流式细胞仪上以间接荧光法检测IL-2/GM-CSF与细胞因子受体细胞PBL、THP-1、K562等结合情况。活体荧光染料CFDA-SE与SNARF-1分别染色后的THP-1和PBL与IL-2/GM-CSF于37℃共同孵育0.5h，在流式细胞仪上观察双色细胞，以测定IL-2/GM-CSF介导PBL与THP-1间的桥联。 MTT法检测BHL-I对PBL增殖的影响，以无增殖活性的靶抗原SKOV3(经50μg/ml丝裂霉素C处理90min)有无存在为对照，同时设立单链抗体对照。MTT法测定不同浓度(1250_2500，625_1250，312_625，156_312，78_156，3978u/ml)IL-2/GM-CSF对PBL增殖作用的影响，及在不同或相同靶受体细胞(THL-1、HL-60、U937、K562)存在下对PBL的促增殖作用，设单体细胞因子和它们的联合使用为对照。 MTT法分析了不同BHL-I浓度、不同效靶比、不同时段内及不同靶细胞等条件下BHL-I介导PBL对SKOV3的杀伤作用；TRIZOL提取BHL-I介导杀伤过程中PBL的总mRNA，用RT-PCR检测Perforin、GranzymeBmRNA的表达，并用生物软件QUALITYONE对mRNA的含量进行灰度分析；同时用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定PBL杀伤过程中混合细胞上清液中hIFN-γ、hTNF-α含量。同样方法研究了IL-2/GM-CSF介导PBL对THP-1的细胞毒作用，设HL-60、U937和K562等白血病细胞为对照；同样方法提取IL-2/GM-CSF介导杀伤过程中PBL的总mRNA，RT-PCR检测作用时间为72h，PBL表达Perforin、GranzymeB、IL-4mRNA的情况，同时测定作用时间为24h、48h、72h细胞混合物上清中hIFN-γ、hTNF-α的含量。利用EB只染死细胞，流式细胞仪测定IL-2/GM-CSF介导PBL对THP-1的杀伤作用。 移植SKOV3(2×106/只)于裸鼠皮下建立卵巢癌动物模型。经裸鼠尾静脉把CFDA-SE(2μmol/L)染色的PBL与BHL-I的混合物移植至荷瘤鼠体内进行治疗。连续测定荷瘤裸鼠体重及瘤体积大小的变化，在整体荧光观察系统下观察BHL-I介导染色的PBL体内分存情况。治疗六周后，处死裸鼠，取肿瘤组织块经电镜前处理后于透射电镜下观察瘤块超微结构；用RT-PCR检测裸鼠重要脏器(肝、脾、肾)及肿瘤组织块中人PerforinmRNA的表达。 结果： BHL-I能介导PBL与SKOV3结合形成花环，并且花环形成率与淋巴细胞结合率显著高于单链抗体和单链抗体联合使用组(P＜0.01)。IL-2/GM-CSF能介导表达IL-2受体的PBL与膜上有GM-CSF受体的THP-1细胞结合，其结合率显著高于对照组。间接荧光法检测表明，IL-2/GM-CSF分别与PBL和THP-1结合数显著高于IL-2/GM-CSF与胞膜上没有相应受体K562细胞间的结合。流式细胞仪检测提示，IL-2/GM-CSF组的双阳性细胞数显著高于对照组。 与对照组比较，在SKOV3靶抗原存在下，BHL-I能显著促进PBL的增殖(P＜0.01)；IL-2/GM-CSF能使PBL增殖(刺激指数)升高，但与对照组间没有显著差别(P＞0.05)，而当膜相应受体细胞(THP-1、HL60、U937)存在时，IL-2/GM-CSF对PBL的刺激指数显著高于对照组。 BHL-I体外介导PBL对SKOV3的细胞毒作用与BHL-I浓度、两细胞比例(效靶比)、作用时间有关，当BHL-I的浓度为40μg/ml、效靶比为10：1、作用时间为24h，PBL对SKOV3的杀伤率达到61.2％，并显著高于对照组。BHL-I介导PBL对SKOV3杀伤率显著高于Bel-7402组。BHL-I介导杀伤过程中，BHL-I+IL-2组的PBLPerforin、GranzymeBmRNA的含量显著高于对照组，混合细胞上清液中的hIFN-γ、hTNF-α含量也显著高于对照组。MTT法检测结果显示IL-2/GM-CSF能促进PBL对THP-1的细胞毒作用，其杀伤率显著高于各对照组(P＜0.01)；而对膜上有相同受体的不同白血病细胞株(THP-1、HL-60、U937)的间杀伤率没有显著差别(P＞0.05)，但均显著高于对膜上没有相应受体的K562细胞的杀伤作用(P＜0.01)。在杀伤过程中72h，IL-2/GM-CSF组的PBL表达Perforin、GranzymeBmRNA量高于对照组；48h细胞混合物上清中hIFN-γ、hTNF-α的含量高于24h与72h的，同时IL-2/GM-CSF组hIFN-γ、hTNF-α高于各对照组。流式细胞式结果发现因THP-1被PBL杀伤而被EB染色的双色细胞数显著高于各对照组(P＜0.01)。 体内实验发现，经尾静脉移植CFDA-SE染色的PBL和BHL-I治疗后，荷瘤裸鼠上的瘤体积增加受抑，其体积增加显著低于没加BHL-I治疗组。透射电镜发现BHL-I治疗组的瘤组织块中有PBL浸润、瘤细胞出现溶解，RT-PCR检测到瘤组织块中有人穿孔素的表达，而没加BHL-I治疗组中未发现PBL和人穿孔素。 结论： 在体外BHL-I能有效地介导PBL与表达相关抗原的SKOV3细胞特异性结合；IL-2/GM-CSF能特异地与胞膜上表达细胞因子相应受体的PBL、THP-1细胞结合，从而介导PBL与THP-1特异性结合形成花环。 BHL-I对PBL的促增殖作用要求相关靶抗原SKOV3存在，IL-2/GM-CSF对PBL的活化与IL-2/GM-CSF相应受体靶细胞是否存在有关。提示靶细胞的存在可能作为抗原递呈细胞，在双功能分子的介导下为PBL的活化直接递呈抗原，从而引起免疫活性细胞PBL的增殖活化。 BHL-I介导PBL的杀伤作用有特异性，只对表达相应靶抗原的细胞有较高的杀伤率。IL-2/GM-CSF介导PBL对髓性白血病细胞的杀伤作用也有特异性，要求靶细胞膜上必须有细胞因子相应受体。双功能分子介导的细胞毒作用与PBL表达hTNF-α、hIFN-γ及Perforin、GrB升高有关。 综上所述，不管是以二个单链抗体组成的双特异性单链抗体，还是以两细胞因子融合而成的细胞因子融合蛋白，双功能分子均能有效地介导效应细胞结合、增殖及对靶细胞的杀伤作用，其杀伤作用与细胞因子hTNF-α、hIFN-γ及Perforin、GrB表达升高有关。该文研究为这二个双功能分子的临床前实验提供实验依据，并为它们的进一步临床应用提供了实验参考数据。那么在双功能分子的介导下，效应细胞是特异性还是非特异性活化正处于进一步的研究中。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章双功能分子BHL-I、IL-2/GM-CSF对淋巴细胞增殖、活化的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二章双功能分子BHL-I、IL-2/GM-CSF体外介导PBL对靶细胞的杀伤作用

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三章双功能分子BHL-I体内介导PBL的细胞毒作用

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

主要英文缩略词表

附 图

文献综述淋巴细胞的伸入运动

成 果

致 谢

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