钩吻素子对小鼠Th细胞因子分泌及胞内钙水平影响的研究

摘要

研究背景：钩吻(GelsemiumelegansBenth，GEB)为马钱科(Loganiacae)植物胡蔓藤的全草，性温味辛、苦，是我国传统的药用植物，也是世界著名的有毒药物。《本草纲目》记载其有解痉、镇痛和利尿之功效。我国福建、广东、广西等民间多外用治疗风湿、疔疮毒肿、跌打损伤及皮肤病等。近年来研究发现钩吻具有多方面的药理作用，如抑制呼吸中枢和心脏收缩作用，松弛平滑肌、镇痛、散瞳、诱导肿瘤细胞凋亡、促进巨噬细胞吞噬功能，及较强抗炎、抑制血小板聚集作用。1887年HGerrad等将其制成格林制剂，并作为法定制剂，为一些国家的副药典所收载；美国药物索引及日本《世界的民间药》中均有钩吻的记载。Calausu等用北美钩吻的水提取物制成口服液及注射剂用于治疗神经性皮炎和银屑病，取得了较好的疗效。 19世纪70年代开始美国研究者T.G.Wormley就已经开始对钩吻活性成分的研究，并分离到了单体；从上世纪30年代国内学者开始对其生药学、化学、毒理及药理学等进行研究。由于钩吻毒性极大，且治疗量和中毒剂量非常接近，限制了它在临床的广泛应用。钩吻中主要含吲哚类生物碱，在植物体内各种生物碱的种类和含量因产地不同而略有差异。钩吻素子(Koumine，Kou)是中国钩吻中含量最高的成分，虽然有一定的毒性，但却不足以代表原植物的毒性。以往研究发现钩吻素子的毒性较低，小鼠ipLD50约为总碱的1/50，因此以钩吻素子作为钩吻的有效活性单体成分，深入研究其抗炎镇痛、抗肿瘤、免疫调节及抗银屑病等作用机制，为进一步将其开发为安全有效的临床制剂提供试验依据。 银屑病(psoriasis)是一种常见的病因不明的鳞屑性慢性炎症性皮肤病，在自然人群的发病率为0.1％～3％。过去认为银屑病是由于角质形成细胞生长异常或炎症导致，认为角质形成细胞是发病机制中的关键因素，但自1986年Valdimarsson等提出银屑病角质形成细胞异常增生可由T细胞局部浸润、活化启动后，T细胞在银屑病发病中的重要作用逐渐为人们所认识。近来研究表明，T细胞是银屑病发病过程中的主要效应细胞，T细胞与角朊细胞的相互作用被认为是最重要的。其免疫发病模式为当外源性抗原出现时，MHC-Ⅱ类DR+抗原递呈细胞将抗原提呈给表皮CD4+T细胞，引起细胞调节的紊乱，导致CD4+T细胞表型和功能的变化，活化的CD4+T细胞释放IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ等细胞因子，刺激表皮角朊干细胞过度增殖异常分化。随着对银屑病发病机理研究的进一步深入，针对银屑病关键步骤的靶位特异性制剂已经成为近年来银屑病治疗研究的方向。 近年来我国在临床研究中发现一些植物药如雷公藤等或其单体对一些类型的银屑病治疗已取得肯定疗效，其初步研究结果提示，中药或植物药在抗银屑病用途方面是有潜力的。本实验室自行提取分离得到钩吻素子单体结晶，观察钩吻素子对鼠尾鳞片表皮和鼠阴道上皮实验模型的影响，发现钩吻素子中、高剂量组能显著抑制阴道上皮细胞有丝分裂、促进鼠尾鳞片表皮颗粒层的生成；钩吻素子低、中、高剂量组均可明显降低小鼠血清IL-2的水平，提示钩吻素子对银屑病动物模型具有一定的疗效。但钩吻素子抗银屑病的确切机理仍不清楚。 研究目的：本研究从银屑病的免疫发病机理和免疫治疗角度出发，以银屑病发病过程中的重要靶细胞T淋巴细胞作为研究对象，进一步分离纯化得到CD4+T细胞，在细胞功能、细胞因子水平及信号传递过程中钙离子浓度[Ca2+]i变化等方面初步探讨钩吻素子对CD4+T细胞的活化、分化过程的影响，明确钩吻素子的免疫调节作用，为进一步明确钩吻素子在银屑病等自身免疫相关疾病发病机制中可能的作用方式及机理，将钩吻开发作为有效的临床制剂提供理论依据。研究内容与方法： T细胞的分离及CD4+T细胞的纯化：以免疫磁珠阴性分选法(MACS)从小鼠脾脏和肠系膜淋巴细胞中分离CD4+T细胞，采用直接免疫荧光法，选用FITC标记的抗CD4单克隆抗体进行标记流式细胞仪(FACS)分析2000个细胞，检测所得细胞的纯度，台盼蓝法检测细胞活力。 钩吻素子对小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响：将10～320μg/ml钩吻素子分别作用于经刀豆蛋白A(ConA)或植物血凝素(PHA)刺激的小鼠CD4+T淋巴细胞，四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖情况。用碘化丙啶(PI)染色，FACS对经钩吻素子作用的CD4+T细胞进行细胞周期分析，初步观察钩吻素子对细胞周期及细胞凋亡过程的影响。 钩吻素子对体外培养CD4+T细胞活化、分化过程中Th1及Th2型细胞因子水平的影响：不同浓度的钩吻素子作用于活化的CD4+T细胞，在不同时间点收集细胞培养上清。用酶联免疫法(ELISA法)，全自动酶标仪450～630nm处双波长测各孔光密度(OD)值，用标准品浓度及对应的OD值(复孔均值)绘制标准曲线，从中求得CD4+T细胞上清中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ及Th2型细胞因子Il4、IL-10的含量。 钩吻素子对小鼠T淋巴细胞内信号传递过程中钙离子浓度的影响：应用激光扫描共聚焦显微镜技术(LSCM)动态测定在钩吻素子的作用下小鼠CD4+T淋巴细胞内[Ca2+]i的变化情况。 结果结论：1.经过流式细胞仪测定分离后的小鼠脾脏CD4+T细胞纯度达到(90.43±1.93)％；0.2％台盼兰染色细胞活力为(94.9±3.6)％，免疫磁珠阴性分选法操作简单、快速，可获得较高纯化率、有活性的CD4+T细胞，利于进行进一步的分组培养、细胞形态学及功能研究。 2.增殖实验表明未加钩吻素子的CD4+T细胞对ConA、PHA的刺激保持了良好的增殖能力，当浓度范围为40～320μg/ml时，钩吻素子均能明显抑制小鼠CD4+T淋巴细胞的增殖(P＜0.05)，且表现出一定的剂量相关性。 3.经100ug/ml钩吻素子作用24小时后，与对照组相比，CD4+T细胞生长周期发生明显变化，G0/G1期细胞从52.2％上升到74.0％，S期细胞从43.3％下降到25.4％，因此推测钩吻素子可能作用于G1期，阻止细胞由G1期向S期的转化，影响细胞的DNA合成。 4.对于Th1型细胞因子，各浓度组钩吻素子作用于经终浓度为5μg/ml的ConA活化的细胞24h后均可显著降低IL-2、IFN-γ的表达，并呈时间及剂量依赖性，200μg/ml钩吻素子组在作用6h后即可表现出对IFN-γ分泌有较强的抑制作用；对于Th2型细胞因子，终浓度为5μg/ml的ConA诱导细胞分泌IL-4总体水平较低，故认为Kou对IL-4表达影响不大。当上清中IL-10水平偏低时，各浓度组Kou均可显著提高IL-10的水平，且在药物作用24h达到最高值，以后逐渐下降，在作用48h时20、200μg/mlKou组又表现出对上升的IL-10水平有抑制作用；与空白对照组比较，100μg/mlKou组作用于细胞不同时间对IL-10的表达均有不同程度的提高，提示100μg/ml的Kou可能有助于促进异常T细胞免疫功能的恢复。Kou可通过促进经有丝分裂原诱导细胞活化、分化的小鼠CD4+T细胞向Th2型分化，降低CD4+T细胞Th1型细胞因子水平、提高Th2型细胞因子水平发挥其调节免疫功能的作用。 5.在静息状态下，Kou对小鼠CD4+T细胞[Ca+2]i影响不大，但可抑制经ConA激活细胞膜上受体依赖的钙离子通道(CRAC)引起的细胞内[Ca2+]i升高，提示Kou可能有抑制活化的淋巴细胞外钙内流作用；经ConA激活的细胞在EGTA存在的情况下，抑制内质网上的IP3受体(IP3R)，Kou可显著降低胞内钙荧光强度，抑制内质网上的Ryanodine受体(RyR)，Kou对胞内钙荧光强度变化影响不明显，当激活内质网上的RyR，经Kou作用后的细胞可见荧光强度有所降低，提示Kou可能通过抑制RyR抑制胞内钙库释放；进一步影响细胞的活化。 总之，本课题首次以体外分离培养的CD4+T细胞作为实验模型，模拟免疫性疾病发病过程，用于药物治疗免疫性疾病作用机制的研究。Kou在体外对活化的小鼠T淋巴细胞具有抑制作用，可在体外抑制淋巴细胞的免疫活性。该抑制作用的部分机制可能是通过作用于活化的小鼠淋巴细胞胞膜上的离子通道及内质网上的Ryanodine受体，抑制细胞外钙内流和内钙释放；同时影响CD4+T细胞细胞因子网络，对Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ分泌的抑制作用及对Th2型细胞因子IL-10有一定的提高作用得以实现。

目录

文摘

英文文摘

第1章钩吻素子对小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响

引言

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

附图

第2章钩吻素子对小鼠CD4+T细胞Th1类及Th2类细胞因子水平的影晌

引言

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第3章钩吻素子对小鼠CD4+T细胞胞内钙离子水平的调节

引言

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

附图

结论

参考文献

文献综述 钩吻生物碱治疗银屑病的研究现状与展望

附录 英文缩略语表

攻读学位期间成果

致谢

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