子宫内膜癌雌激素依赖型与非依赖型基因表达谱的初步研究

摘要

在美国，子宫内膜癌(endometrialcarcinoma)是一种最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，在所有的肿瘤中排名第四，仅次于乳腺癌、肺癌和大肠癌。2000年，美国大约新增36,100新病例，约有6,500死于这种疾病。我国子宫内膜癌也已成为女性最常见的恶性肿瘤之一。 一般认为，子宫内膜癌的发生与雌激素长期刺激有直接关系，是一种雌激素依赖性肿瘤，其发现较早，预后较好，5年生存率达70％左右。但在实际临床工作中发现：部分患者，尤其是绝经后患者，并无内源性或外源性高雌激素的表现，而且激素治疗效果不好，预后较差。 本研究应用美国Affymetrix公司制备的HumanGenomeU133Plus2.0原位合成寡核苷酸芯片(该基因芯片一共有54,614个探针组，分析47,000个转录本和变异体，其中包括了可能的38,500个已知基因)对子宫内膜癌Ⅰ型(实验组)和Ⅱ型(对照组)样品各3例配对进行了检测，希望能初步探讨两种亚型相应的分子生物学标志，进而为子宫内膜癌的诊断、治疗和评估预后提供分子依据。 6例标本总RNA被提取纯化后，mRNA反转录合成cDNA，然后体外转录合成cRNA并用生物素标记，与寡核苷酸芯片进行杂交反应。芯片图像扫描后经软件处理，杂交信号以数据的形式输出。扫描后的原始数据进一步经标准化处理后得到标准化的各探针组的“报告信号值”。由于每个探针组由11-20个PM-MM探针对组成，如果要判定检测样品中基因的是否表达，需对探针组各PM-MM探针表达信号值行符号秩和检验(One-sidedWilcoxon'sSignedRanktest)。当探针组各PM-MM探针对表达信号检验P值＜0.04时，判定该基因或EST在样品中表达(PresentP)；当P值＞0.06时，判定该基因或EST在样品中不表达(AbsentA)。该基因或EST介于表达与不表达之间时以(marginalM)代表。利用统计学方法比较子宫内膜癌Ⅰ型和Ⅱ型两种样品之间探针杂交荧光强度比值，建立两者之间的基因差异表达谱。 根据Affymetrix基因芯片数据筛选标准，发现所有上调基因和EST序列为2,971个，其中差异倍数在一倍以上的有888，二倍以上的有222个；下调基因和EST为3,812，其中差异倍数在一倍以上的有2,301个，二倍以上的有742个。 随后，基因芯片结果半定量RT-PCR验证。6个基因被随机选择，其中CXCL5、LY6D和LEFTY1在子宫内膜癌Ⅰ型中高表达，而IFNG、FGF1和ORM2子宫内膜癌Ⅱ型中高表达。结果显示，基本上所有的RT-PCR检测表现出与芯片结果一致的变化趋势，表明了芯片结果的可重复性。 1.上调基因 1.1雌激素代谢和转化基因： CYP2C9编码了细胞色素P450超家族酶成员中的一员。细胞色素P450超家族为单加氧酶，能催化多种反应，涉及代谢、合成胆固醇、类固醇和其它脂质。CYP2C9定位在内质网上，其表达受rifampin诱导。该酶是众所周知的代谢phenytoin，tolbutamide，ibuprofen和S-warfarin。研究鉴定有些个体在代谢phenytoin和tolbutamide能力很差，暗示该基因多态性。Modugno等利用半定量RT-PCR分析29对乳腺癌及临近非癌组织¨CYPs(CYP1A1，CYP1A2，CYPB1，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C18，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4，andCYP3A5)mRNA表达发现，仅仅只有四个CYPs(CYP1A1，CYPB1，CYP2C9，CYP3A4)在乳腺癌及临近非癌组织能检测到表达。其中CYP1A1，CYPB1，CYP3A4涉及了雌二醇羟基化作用，CYP2C9参与了雌酮硫酸盐转化为16-羟基硫酸盐代谢。CYP2C9高表达是由于雌激素的高表达诱导所至，参与了雌激素的代谢。 脱氢表雄酮硫酸转移酶(dehydroepiandrosteronesulfotransferaseDST)基因编码黏附连接板蛋白plakin蛋白家族成员之一参与了类固醇激素硫酸化。许多类固醇激素硫酸化被发现发生在胎儿和成人的几处组织里。脱氢表雄酮硫酸盐在发育中的胎儿中产量很高，认为主要是人在怀孕状态下高雌激素的缘故。Ⅰ型子宫内膜癌由于处于高雌激素刺激状态，因此，DST表达也由于雌激素的原因而高表达，由此也认为，该基因也会随着雌激素含量的降低而表达下调。DST基因或许可以作为Ⅰ型子宫内膜癌的标志物和治疗反应预后标志物之一。 1.2雌激素调节基因 CFTR(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator)，又称为ABCC7，是ABC转运子超家族中MRP亚家族中成员之一，涉及了多药耐药。该蛋白是一种cAMP激活的氯离子通道，控制其它转运通路的调节。这种基因突变在常染色体隐性疾病囊肿性纤维化和先天性双侧输精管萎缩症已经被发现。Rochwerger等首次报道了在活体内小鼠子宫上皮中，CFTR表达调节是依赖于雌激素。随后他们在体外，通过新建的子宫上皮细胞系证实，CFTR的表达由雌激素控制。Tsang发现，在无酚红的培养基中，forskolin-stimulatedI(SC)表达明显下调，进一步在charcoal/dextran处理的fetalbovineserum(FBS)中，此时类固醇激素已经被除掉，SC含量继续降低。而forskolin-stimulatedI表达上调是由CFTR介导，这暗示了酚红和类固醇激素可以上调CFTR的表达。CFTR在女性生殖管道中表达，但其在子宫中的功能一直不是很清楚。Rowlands等利用RT-PCR方法，通过在卵巢切除的小鼠比较17beta雌二醇(17beta-oestradiol)和BakFoongPill(BFP)治疗后CFTR在子宫中的表达水平来研究其生理作用。结果发现，17beta雌二醇和BakFoongPill都能上调CFTRmRNA的表达。该结果暗示CFTR可以被雌激素诱导表达上调，显示了CFTR可能在生殖功能中起了重要作用。子宫内膜癌Ⅰ型是雌激素依赖型的恶性肿瘤，雌激素的持续刺激是导致肿瘤发生的主要原因。CFTR在子宫内膜癌Ⅰ型中高表达，反过来暗示了这型病人有雌激素的高表达。因此，CFTR或许可以作为该型的生物学标志物之一，区分Ⅱ型子宫内膜癌。 Wafa利用酵母双杂交技术发现，DDC(L-dopadecarboxylase)能与AR(androgenreceptor)相互作用(AR是配体调节转录因子，属于类固醇受体家族，在前列腺的生长和发育上发挥了关键的作用)，增强类固醇受体的转录活性，或许与前列腺癌的发生有关。该基因表达在子宫内膜癌Ⅰ型中表达，或许也是通过类似作用，参与了雌激素(类固醇激素)依赖的子宫内膜癌的发生。 SOCS-3是细胞信号蛋白家族抑制子，负性调节细胞因子作用。Matthews等研究雌激素(E2)对T47D和MCF-7人乳腺癌细胞系中SOCS-3表达影响发现，ERalpha能直接调节人乳腺癌细胞中人SOCS-3启动子的活性，因此调节细胞因子的活性。Leong等发现，在培养的人肝细胞中，雌激素能以时间和剂量依赖的方式增加SOCS-3的表达。用雌激素长期处理野生型和ERbeta基因敲除小鼠中(3week)发现，肝脏SOCS-3被诱导表达升高2-3倍，而ERalpha基因敲除小鼠却无SOCS-3表达上调。这暗示了雌激素通过ERalpha上调肝细胞SOCS-3的表达。该基因在子宫内膜癌Ⅰ型中高表达，主要也是由于雌激素诱导所致，可能参与肿瘤的发病过程。 2.下调基因 Fos基因家族包括四个家族成员：FOS，FOSB，FOSL1和FOSL2。这些基因编码亮氨酸拉链，能与JUN蛋白家族二聚体化，形成转录因子复合物AP-1。FOS蛋白家族已经牵涉到细胞的增殖、分化和转化等。子宫内膜癌Ⅱ型相对Ⅰ型更加恶劣，预后较差。FOSB在Ⅱ型子宫内膜癌中相对高表达，支持该型肿瘤恶性程度较高。 NTRK2编码神经酪氨酸受体激酶家族成员之一。这种激酶是一种膜结合受体，能磷酸化自身以及MAPK通路成员，信号通过该激酶导致细胞增殖。该基因在Ⅱ子宫内膜癌中高表达，可能参与了肿瘤细胞的增殖。JUN是一种癌基因，这种基因为推测性的鸟类肉瘤病毒17的转化基因。它编码一种与病毒蛋白高度相似的基因，能直接与特异的靶DNA序列相互作用。Yokoyama等报道那些c-jun阳性病人与c-jun阴性病人相比较，预后更差。另外，他们还发现，c-jun的表达与淋巴结转移呈正相关，因此认为c-jun能促进子宫内膜癌转移。Salmi在研究恶性子宫内膜与正常周期的子宫内膜时发现，c-jun和ER的表达相关性已经丢失。Li等发现，在绝经期后的子宫内膜癌患者，相对于正常对照、绝经后子宫出血和萎缩的子宫内膜病人，其血浆和子宫分泌液中PP14的浓度明显升高，提示PP14与子宫内膜癌组织病理学类型相关。我们芯片数据显示，PP14在Ⅱ型子宫内膜癌中表达更高，提示该基因有潜质作为Ⅱ型子宫内膜癌的标志物。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章临床资料分析

第二章子宫内膜癌雌激素依赖型与非依赖型基因差异表达初步检测

第三章数据处理和生物信息学分析

第四章半定量RT-PCR鉴定芯片结果

讨论

参考文献

英语缩写注解

攻读学位期间的成果

致谢