嵌合体供者诱导异种皮肤移植免疫耐受的研究

摘要

目前，随着休克复苏、抗感染和代谢支持等治疗措施的不断完善，大面积严重烧伤病人的救治成功率逐渐提高。但自体皮源严重不足依然是导致大面积严重烧伤病人感染、脓毒症和多器官功能衰竭而死亡的主要原因。延长异体(种)皮存活时间、促进微粒自体皮扩增是治疗大面积严重烧伤病人的重要步骤之一。近年来，一些实验证实，利用骨髓干细胞诱导免疫系统尚未发育成熟的异种动物胚胎形成异种造血细胞嵌合体后，将其组织器官移植给造血干细胞的供者，可诱导产生“移植物免疫耐受”和“免疫适应性”。但有关异种造血细胞嵌合体作为异种皮肤移植的供者，能否产生免疫适应性从而延长其存活时间的动物实验和临床研究尚未见报道；对异种造血细胞嵌合体供者诱导的异种移植免疫耐受的机制尚不清楚。 补体调节蛋白的种属差异是导致异种移植超急性排斥反应的主要原因。作者推测，嵌合体供者诱导的异种移植物免疫耐受，可能与嵌合体内的异种嵌合细胞表达其种属特异性的补体调节蛋白有关。本研究拟通过检测嵌合体组织中嵌合的异源性细胞及其补体调节蛋白(hCD55和hCD59)的分布，分析探讨造血细胞嵌合体供者诱导异种皮肤移植免疫耐受的可能性及其机制，为嵌合体供者诱导异种皮肤移植耐受的实验研究提供理论依据；通过嵌合体供者异种皮肤移植的实验研究，观察嵌合体供者异种皮肤移植后，移植物排斥时间和创面愈合时间，为嵌合体供者诱导异种皮肤移植免疫耐受的临床研究奠定基础。 第一部分嵌合体供者诱导异种移植免疫耐受机制探讨 目的：利用人脐血干细胞嵌合体大鼠模型，检测hCD45、hCD55和hCD59阳性细胞在组织和血液细胞中的分布，以分析嵌合体供者诱导异种移植物免疫耐受的机制，探讨嵌合体供者诱导异种皮移植免疫耐受性的可行性。 方法：采用宫内胎鼠移植加新生鼠肝内注射人脐血干细胞的方法，制作人造血干细胞嵌合体大鼠模型。4周后，利用免疫组化和流式细胞三色标记法，检测嵌合体大鼠体内人源性细胞和人源性补体调节蛋白——hCD55和hCD59抗原；对hCD45/SSC设门时，不同区域内hCD55和hCD59抗原阳性细胞的分布进行分析；以补体依赖性淋巴细胞毒性反应评估嵌合体供者异种移植免疫适应性；用SPSS(11.0)统计学软件包，分析补体依赖性淋巴细胞毒性反应与外周血细胞补体调节蛋白的相关关系。 结果：嵌合体大鼠脾脏、骨髓、心脏和皮肤中有人源性β2微球蛋白阳性细胞和hCD55、hCD59抗原存在。外周血中hCD45、hCD55和hCD59阳性细胞的比率分别为6.23(±2.68)％、2.56(±0.89)％和1.56(±0.91)％。选择hCD45/SSC设门时，在hCD45阳性细胞区域中，hCD55和hCD59阳性率分别高达53.69(±18.23)％和31.8(±27.5)％，但仅占全细胞总数的2.0(±1.32)％和0.76(±0.56)％，而全细胞区域中hCD55和hCD59阳性细胞的百分率分别为4.11％(±2.83)％和2.82％(±1.38)％，差异具有显著性意义(t=2.71，P=0.043；t=3.64，P=0.015)。嵌合体大鼠补体依赖性淋巴细胞毒性反应为22.32(±15.10)％，低于非嵌合体组大鼠的57.29(±22.65)％，差异具有非常显著性意义(t=4.16，P＜0.001)。相关分析显示，嵌合体大鼠的补体依赖性淋巴细胞毒性反应结果与外周血hCD55阳性细胞百分率呈负相关(r=-0.679，P=0.031)；外周血hCD55百分率和hCD45阳性细胞百分率呈正相关(r=0.658，P=0.038)。 结论：1、采用宫内胎鼠移植加新生鼠肝内注射人脐血干细胞的方法制作的人造血干细胞嵌合体大鼠模型，嵌合比例高，效果稳定可靠。2、外周血hCD45阳性细胞区域即是能表达人补体调节蛋白的人脐血干细胞来源的嵌合细胞群；hCD45阴性区域也有hCD55和hCD59阳性细胞存在，可能与糖基磷脂酰肌醇连接的hCD55和hCD59抗原在细胞间的迁徙有关。3、人造血细胞嵌合体淋巴细胞具有抵抗人补体对细胞融解、破坏作用。4、随着嵌合体嵌合比例的增加，人源性补体调节蛋白表达增多，嵌合体外周血淋巴细胞抵抗人补体的融解、破坏作用增强。5、嵌合体内异种补体调节蛋白的存在，可能是造血细胞嵌合体供者诱导异种移植物免疫耐受的基础；嵌合体动物作为异种皮肤移植的供者，有可能诱导移植物免疫耐受。 第二部分嵌合体供者异种皮移植的实验研究 目的：通过嵌合体大鼠-供髓兔异种皮肤移植，探讨嵌合体供者诱导异种皮肤移植免疫耐受的可行性。 方法：实验分为A组和B组。采用兔骨髓干细胞经宫内胎鼠移植加新生鼠肝内注射的方法，制作兔骨髓干细胞嵌合体大鼠模型，非嵌合体对照大鼠以同法注入磷酸盐缓冲液(PBS)。6周后，通过嵌合体大鼠-供髓兔补体依赖性淋巴细胞毒性反应结果，选择合适的嵌合体大鼠进行异种皮肤移植。A组将嵌合体大鼠皮肤移植给供髓兔，将非嵌合体大鼠皮肤移植给正常兔作对照；B组将嵌合体大鼠和非嵌合体大鼠皮肤同时移植给供髓兔。观察异种皮肤移植后移植物存活时间和创面愈合时间，用SPSS(11.0)进行比较分析。 结果：A组非嵌合体大鼠皮肤于移植后9.29(±1.80)天排斥脱落，创面裸露，并有坏死组织残留；于移植后20.86(±2.12)天创面愈合；嵌合体大鼠皮肤于移植后15.13(±2.64)天逐渐脱落，于移植后18.5(±1.31)天创面愈合。与非嵌合体大鼠皮肤相比，嵌合体大鼠皮肤移植后存活时间延长，具有非常显著性意义(t=4.92，P＜0.001)；愈合时间缩短，具有显著性意义(t=2.55，P=0.029)。B组非嵌合体大鼠皮肤于移植后10.14(±1.86)天脱落，于20.42(±2.64)天创面愈合；嵌合体大鼠皮肤于移植后13.43(±3.65)天逐渐脱落，于移植后16.29(±3.35)天创面愈合。两者相比，嵌合体大鼠皮肤移植后存活时间延长、愈合时间缩短均具有非常显著性意义(t=4.223，P=0.006；t=4.101，P=0.006)。嵌合体大鼠皮肤脱落后大部分创面基本愈合，无渗出，于脱落后2.14(±3.58)天完全愈合；非嵌合体大鼠皮肤脱落后大部分(7/7)创面感染、渗出，(6/7)有坏死组织残留，于移植皮肤脱落后10.71(±2.14)天创面愈合。与A照组相比，B组嵌合体大鼠皮肤平均排斥时间和愈合时间均提前2天左右，但差异无显著性意义(t=1.042，P=0.316；t=1.73，P=0.107)；非嵌合体大鼠皮肤平均排斥时间延迟1天，亦无显著性意义(t=0.875，P=0.399)，创面愈合时间非常接近(t=0.335，P=0.743)。 结论：1、嵌合体大鼠皮肤异种移植后能诱导移植物免疫耐受，使存活时间明显延长，创面愈合时间显著缩短。2、补体依赖性淋巴细胞毒性反应可以作为异种皮肤移植前筛选合适供者的一个简单、有效方法。 总之，本实验结果证实了造血细胞嵌合体内的异种嵌合细胞能表达其种属特异性的补体调节蛋白CD55和CD59，而这些GPI连接的补体调节蛋白能够在异种细胞间迁徙，并发挥其抵抗同种补体的细胞破坏作用；嵌合体内异种补体调节蛋白的存在，可能是造血细胞嵌合体供者诱导异种移植物免疫耐受的基础；嵌合体作为异种皮肤的供者，移植后能诱导产生移植物免疫耐受，使其存活时间明显延长，创面愈合时间显著缩短。实验结果显示出良好的研究、应用前景，为嵌合体供者诱导异种皮肤移植免疫耐受的研究向大动物过渡甚至为临床应用提供了重要的理论依据和技术支持。

目录

文摘

英文文摘

第一部分嵌合体供者诱导异种移植免疫耐受机制探讨

第二部分嵌合体供者异种皮移植的实验研究

全文小结

综述

英文缩写一览表

攻读学位期间成果

致谢

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