基因芯片技术在HPV18 E6 siRNA诱导HeLa细胞凋亡机制研究及HPV检测分型中的应用

摘要

宫颈癌是世界范围内最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，死亡率仅次于乳腺癌占女性癌症死亡率的第二位。全球每年新发病例约40万且有超过20万妇女死于该病，其中80％的病例发生在发展中国家，我国每年新发病例约13万。目前研究已证实某些型别的人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染与宫颈癌的发生、发展密切相关。 人乳头瘤病毒属乳多空病毒科，是一类特异感染人皮肤和粘膜的双链闭合环状DNA病毒。HPVDNA分子约含8,000个碱基，基因组按功能分为3个编码区：早期区域(earlyregion，E)，长约4,500bp，包含E1，E2，E4，E5，E6和E7共6个开放阅读框，负责编码参与病毒DNA复制转录和细胞转化的蛋白；晚期区域(lateregion，L)，长约2,500bp，含L1和L2基因，编码病毒结构蛋白；非编码上游调节区，长约400-1,000bp，包含启动子等调控元件，与病毒复制转录的调控有关。 近年来的研究热点RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术可以代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，将与内源mRNA序列相对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可使内源mRNA降解和基因沉默。与反义寡核苷酸和核酶的抑制效果相比，RNAi技术抑制基因表达具有更高的效率，无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA(每个细胞几个分子)就能有效的抑制靶基因表达，抑制效率在低等动物中＞90％，在哺乳动物中也＞50％。RNAi由于具有特异性、高效性等特点，可以克服一般药物易产生耐药性及毒副作用强、反义寡核苷酸效率低、基因敲除时效周期长的缺点，因此可以用于肿瘤、病毒感染等疾病的治疗。 由于HPVE6蛋白的表达对宫颈癌的发生发展必不可少，因此E6基因是宫颈癌基因治疗的理想靶标。目前已有研究发现针对HPV16E6基因的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)能有效杀死HPV感染阳性的宫颈癌细胞，但HPVE6蛋白致癌机制中具体有哪些基因共同参与细胞恶性转化仍有待进一步研究。为更好的解决这一问题，我们将RNA干扰技术与DNA芯片技术这两个功能基因组研究中强大的工具相结合，从而更全面、深入的研究与病毒致病性相关的基因功能。 肿瘤细胞通常都具有抗凋亡活性，以维持细胞的生存和恶性增殖，抑制这种抗凋亡活性一直是肿瘤治疗的重点策略。在许多与病毒感染相关的肿瘤中，多由病毒编码的癌蛋白提供给肿瘤细胞抗凋亡的活性。因此，抑制这些病毒癌蛋白的抗凋亡功能，可以特异的针对含有病毒的肿瘤细胞，而对其它未感染的细胞没有影响。本研究以HPV18转化的人宫颈癌细胞系HeLa细胞为模型，利用siRNA特异抑制病毒癌基因E6的表达并诱导细胞发生凋亡，再结合高通量的寡核苷酸芯片技术对E6-siRNA诱导HeLa细胞凋亡后的基因表达谱改变进行研究，利用生物信息学方法将大量E6调控相关的差异表达基因按照生物学功能归类，可以从整个基因组水平对肿瘤细胞的基因表达调控网络进行系统全面的研究，从中发现新的肿瘤相关基因，为宫颈癌的发病机制、药物研发、疫苗研制、基因治疗等更深入的课题提供理论依据。 本研究主要分为以下三方面： 第一部分：特异siRNA对宫颈癌HeLa细胞中HPV18E6基因的抑制及诱导细胞凋亡的研究。针对HPV18E6基因设计siRNA序列，利用人源U6启动子为模板经PCR表达框架法体外扩增，得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物，利用LipofectamineTM2000脂质体转染HeLa细胞，在U6启动子的作用下于细胞内转录E6-siRNA。同时设计合成阴性对照组m-siRNA，与E6-siRNA碱基组成相同、序列打乱，与靶细胞中其他基因没有同源性。针对转染后不同时间点，采用相差显微镜观察细胞形态学改变、四唑盐(MTT)比色法测定细胞活力、流式细胞仪碘化丙啶(propidineiodide，PI)染色法检测细胞凋亡率、RT-PCR测定HPV18E6mRNA变化。研究结果发现转染E6-siRNA后HeLa细胞活力受到显著抑制(P＜0.05)，光镜下细胞皱缩，贴壁不牢固，部分细胞染色质聚集，呈现明显的凋亡形态。DNA凝胶电泳出现典型的凋亡“梯状”带，流式细胞仪检测24h、48h和72h细胞凋亡率持续上升，分别为26.4％、40.3％和55.8％。RT-PCR结果显示细胞转染24、48和72h后HPV18E6mRNA较未转染的正常细胞分别减少了57％、78％和40％，而阴性对照组细胞与未转染细胞相比E6mRNA表达差异不显著。表明siRNA可特异有效地干扰宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。 第二部分：应用AgilentHuman1A寡核苷酸芯片系统研究HPV18E6-siRNA诱导HeLa细胞凋亡的基因表达谱改变。干扰实验进行24h后，分别提取E6-siRNA组与m-siRNA阴性对照组细胞的总RNA，利用AgilentRNA荧光线性扩增试剂盒合成荧光标记的cRNA，E6-siRNA组用Cy3标记，m-siRNA组用Cy5进行标记。标记好的cRNA样品经纯化后与寡核苷酸芯片杂交，Agilent2565BA基因芯片扫描仪进行扫描，AgilentFeatureExtraction软件进行数据分析及标准化处理。根据软件给出的LogRatioPValue确定表达差异的基因，结合PANTHER数据分析系统将这些基因按照生物学功能进行归类，查阅GenBanK数据库及相关文献对其结果进行深入的分析及讨论。实验结果表明在检测的18716个基因和EST中，共筛出差异表达基因359个，其中307个基因表达上调，52个基因表达下调。这些差异表达的基因主要包括以下几类：①与细胞周期相关；②与细胞凋亡相关；③与细胞增殖和分化相关；④与蛋白质合成、代谢与修饰相关；⑤与信号转导相关；⑥与核酸代谢相关；⑦与免疫防御机制有关；⑧与转录调控相关等。通过对细胞周期相关基因CCNG1、p21；凋亡相关基因CASP4、CASP6、IGFBP3、DFFA；泛素蛋白酶解途径相关基因UBE3A、UBE2C；角化细胞分化相关基因KRT4、KRT6E、KRT18；抑癌基因RECK、VHL等差异表达基因的功能和所处信号传导通路进行了详细的分析后，发现CCNG1、p21和IGFBP3都是P53调控的关键下游靶基因，参与P53介导的细胞周期调控和诱导凋亡，因此进一步证实HPV18E6基因抑制引起的细胞凋亡效应主要是通过P53信号途径和泛素蛋白酶解信号途径调节细胞周期相关基因和凋亡相关基因的表达，从而抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡。同时，抑癌基因的激活，角化细胞分化相关基因和免疫相关基因的表达上调都说明了E6抑制后肿瘤细胞恶性转化程度的下降。 第三部分：应用SYBRGreenⅠ嵌合荧光检测PCR法对芯片筛选出的4个HPV18E6-siRNA诱导的差异基因(CCNG1、p21、IGBP3、UBE3A)和HPV18E6基因进行相对定量验证。实验以E6-siRNA组与m-siRNA阴性对照组细胞的总RNA为模板，使用2步法荧光定量PCR方法，扩增目的基因，同时设立看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内标。标准品的制备采用以高浓度的HeLa细胞总RNA溶液为模板进行反转录得到的cDNA溶液，使用EASYDilution按10倍稀释4个梯度进行PCR反应，同时掺入SYBRGreenⅠ。反应结束后，根据内标GAPDH和目的基因的各扩增曲线得到的Ct值分别制作标准曲线，进行目的基因mRNA的相对定量。结果发现E6基因在siRNA干扰后24h的表达量与对照组相比为0.395∶1，说明E6-siRNA基因抑制效果明显。E6-siRNA组与m-siRNA组的CCNG1、p21、UBE3A和IGFBP3的基因表达量相对比值分别为5.92、3.46、0.456和3.02；与芯片差异表达情况基本一致(5.24、2.87、0.532和2.29)。通过Real-timePCR证明了芯片杂交结果可靠准确，在E6-siRNA转染后这些基因确实存在着表达差异。 第四部分：设计并制备长链寡核苷酸芯片用于HPV病毒检测分型的初步研究。对四型HPV(6，11，16，18)全基因组序列进行分析，应用探针设计软件Arraydesigner2.0和序列比对BLAST检索软件设计特异性高、溶解温度(Tm)和GC含量相近的HPV型特异性～60mer寡核苷酸探针，点样制备成寡核苷酸基因芯片。将含HPV全长基因序列的质粒作为阳性标准品，利用限制性荧光标记技术对其进行荧光标记，标记好的样品与芯片杂交，初步探索寡核苷酸基因芯片在HPV病毒检测和分型中的应用前景。结果表明荧光标记的四型HPV样品与大部分相应的型特异性探针杂交有明显的荧光信号，可以根据杂交结果进行初步的分型检测，而与阴性对照探针和空白对照探针没有杂交信号。我们根据初步杂交结果筛选出10条型特异性探针重新打印芯片，通过对芯片片基处理和样品荧光标记方法的优化，提高了芯片的杂交特异性和荧光信号强度。综上所述，采用合理设计的60mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对HPV的检测和分型。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章HPV18 E6基因siRNA诱导HeLa细胞凋亡的研究

第二章应用寡核苷酸芯片研究E6-siRNA诱导HeLa细胞凋亡的基因表达谱变化

第三章应用实时定量PCR技术验证芯片差异基因的表达

第四章人乳头瘤病毒检测分型寡核苷酸芯片的初步研究

结论

参考文献

附录 英文缩写词表

成果

致谢

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