ABC转运蛋白在鼻咽癌中的表达研究

摘要

肿瘤是危害人类健康的重大疾病，在肿瘤的治疗中，多药耐药现象一直是限制肿瘤化疗成功的主要原因。引起肿瘤多药耐药的机制非常复杂，其中ABC转运蛋白所介导的肿瘤多药耐药备受关注。 ABC转运蛋白全称为ATP结合盒膜转运蛋白(ATPBindingCassetteTransporters)，它们能够介导多种底物分子在细胞内外的运输。研究发现，ABC转运蛋白的泵功能与肿瘤细胞内药物聚集的降低有关，能够使肿瘤细胞产生多药耐药性(Multidrugresistance，MDR)从而导致化疗失败。而随着肿瘤干细胞学说的提出，更认为在化疗中，肿瘤干细胞上转运蛋白表达增强，对药物外排的增加使肿瘤逃避化疗药物攻击，存活并复发、转移。其中尤以ABCG2更受到人们关注，认为它不仅是耐药蛋白，同时也可能是干细胞的潜在标志物。 鼻咽癌是我国南方常见的上皮性恶性肿瘤。高发地区的发病率可达14.68-18.53/10万人口，死亡率为12.46/10万人口。在鼻咽癌的治疗中，由于就诊病人多为中晚期患者，单纯的放疗不能有效缓解临床症状，局部复发和远处转移率很高，因此必须结合有效的化疗。而研究发现，鼻咽癌中存在多药耐药的现象，是鼻咽癌化疗效果无法进一步提高的主要原因。因此检测与耐药相关的ABC转运蛋白在鼻咽癌细胞株及组织中的表达情况，初步探讨鼻咽癌中多药耐药的机制，是非常有意义的。 采用SYBRGreenⅠQRT-PCR(quantitatierealtimePCR)技术对靶基因进行实时荧光定量分析是近年来发展起来的一项新技术。SYBRGreenⅠ是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。因此，它的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系中存在的双链DNA数量，并且通过熔解曲线的分析，排除非特异性扩增的干扰，对靶基因进行定量分析，准确性和灵敏性都比普通RT-PCR高。通过2-△△CT方法利用SYBRGreenⅠQRT-PCR技术能够很好的分析基因表达相对差异。用2-△△CT统计分析基因表达相对定量的方法在很多文献中有报道，由于这种方法无需做标准曲线，因此比绝对定量方法更加简便可行。 目前国内外关于ABC转运蛋白在鼻咽癌中的研究并不多见，并且多是采用免疫组化方法从蛋白水平研究多药耐药蛋白MDR1(ABCB1基因编码)和多药耐药相关蛋白MRP1(ABCC1基因编码)的文章，对于ABC转运蛋白在鼻咽癌中的表达情况缺乏系统了解。因此，我们采用准确性和灵敏性较高的QRT-PCR技术检测了ABC转运蛋白家族中十个与耐药密切相关的成员(ABCA2、ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC6、ABCC11、ABCG2)在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2、HNE-1以及25例鼻咽癌组织中的表达情况，并以一个含多例鼻咽正常组织的混合RNA作为正常对照，通过2-△△CT方法和t检验分析了十种基因在鼻咽癌细胞株、鼻咽癌组织与鼻咽正常组织中的表达差异；同时我们用化疗药物顺铂作用于鼻咽癌细胞株5-8F，比较了其在药物诱导前后ABC转运蛋白表达的变化。此外，还采用原位杂交检测方法对ABCG2基因在鼻咽癌组织中的表达进行了定位分析。 荧光实时定量PCR的结果表明在鼻咽癌细胞株中，ABCA2、ABCC1、ABCC2和ABCC3均为高表达，ABCG2在五种细胞株中均稳定低表达，而经典耐药蛋白MDR的编码基因ABCB1的表达则非常低，仅6-10B细胞中有极低表达。在25例鼻咽癌组织中，ABCA2、ABCC1和ABCC3也有较高的表达，其△Ct值均＜10，而ABCG2表达量较低，25例组织中20例均为低表达。再通过2-△△Ct的方法分别比较了ABC转运蛋白在鼻咽癌组织、鼻咽癌细胞株与正常鼻咽组织中的相对表达差异，我们发现鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞株中ABC转运蛋白的表达水平相对与正常鼻咽组织具有一致性，即ABCA2、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5以及ABCG2的表达均高于其在正常鼻咽组织中的表达，而ABCC6、ABCC11和ABCB1都低于其在正常鼻咽组织中的表达。通过T-test检验，我们得到了ABCC1、ABCC2、ABCC4、ABCC5和ABCG2这五个基因在鼻咽癌组织中的表达要显著高于其在正常鼻咽组织中的表达(P＜0.05)。 同时，我们检测经顺铂诱导后5-8F细胞株中ABC转运蛋白的表达变化，结果提示ABCC1和ABCC4这两种基因的表达上调是比较明显的，分别比未经顺铂诱导的5-8F细胞株中这两种基因的表达升高了3.05倍和8.16倍。 对ABCG2基因在鼻咽癌组织中的原位杂交结果显示，ABCG2基因的表达定位于鼻咽癌实质细胞，在淋巴细胞和间质中没有表达；在所检测的36例鼻咽低分化鳞状细胞癌中，ABCG2表达阳性的有6例。 根据实验结果，我们把这十种ABC蛋白的表达情况分为三类，第一类是在鼻咽癌组织和正常鼻咽组织中都高表达的基因，包括ABCA2、ABCC1和ABCC3，其中ABCA2和ABCC3在鼻咽癌组织和正常鼻咽组织中的表达没有显著差异，而ABCC1在肿瘤组织中的表达则要明显高于其在正常组织中的表达，并且ABCC1编码的多药耐药相关蛋白MRP1的高表达是导致许多肿瘤内在性耐药的原因，因此这提示鼻咽癌也存在天然耐药性，当使用的化疗药物为这些转运蛋白的转运底物时，它们对鼻咽癌的化疗效果是非常差的。 第二类是在正常鼻咽组织中低表达而在鼻咽癌中表达显著升高的，比如ABCC2、ABCC4、ABCC5和ABCG2，因此它们在鼻咽癌的耐药中可能起着重要作用。其中ABCG2基因我们同时用了QRT-PCR和原位杂交方法相结合来检测，结果显示它的表达量在大多数样本中是非常低的，以至于很难检测到它的表达，个别组织标本中ABCG2表达较高提示其在鼻咽癌中表达的个体差异很大，高表达的样本可能是个别耐药病例。 此外第三类基因是在鼻咽癌组织和正常鼻咽组织中都低表达的基因，它们是ABCB1、ABCC6、ABCC11，并且它们在两类样本中的表达没有显著差异，因此它们与鼻咽癌耐药的关系还有待研究。

目录

文摘

英文文摘

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

缩写词简表

ABC膜转运蛋白及其介导的肿瘤多药耐药研究进展

致谢

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