人发角蛋白—胶原海绵—聚甲基丙烯酸羟乙酯复合生物敷料的研制

摘要

第一部分 人发角蛋白-胶原海绵的组织相容性和生物可降解性评价 有关HHK的化学成分、性质，生物学性能，生物、组织相容性及HHK人工腱的生物力学性能等，我们的前期研究中已阐明，但其在皮肤组织工程中的应用尚鲜有报道。胶原海绵已广泛用作皮肤的支架材料，但其易收缩、机械强度小等缺点依然是亟待解决的课题。 目的：研究HHK-胶原海绵体内的组织相容性和生物降解性 方法： 1、用可控性的物理、化学处理方法制备具有轻(Ⅰ)、中(Ⅱ)、重(Ⅲ)不同处理程度的三种HHK组分材料。 2、用牛跟腱为原料，经酸溶解、抽提、离心、盐析等步骤制备Ⅰ型胶原(经SDS-聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)电泳证实)，并与6-硫酸软骨素进行初交联。3、将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种组份的丝状HHK以3∶3∶4的比例编织成网孔大小为1×1mm2的网格状支架，与Ⅰ型胶原蛋白一同置于模具内经真空冷冻干燥后成膜，制成HHK-胶原海绵膜。 4、将HHK-胶原海绵复合膜置于0.25％的戊二醛溶液中浸泡再交联，反复漂洗后干燥备用。 5、成品的胶原海绵经扫描电镜观察海绵状结构，测其孔径大小。 6、实验设计和分组：将大小均为1×1cm2的“三”种材料(实验组植入HHK-胶原海绵，阳性对照组单纯植入胶原海绵，阴性对照组不植入任何材料)分别埋植于21只SD大鼠背部皮肤的真皮与皮下组织之间，以背部正中线为轴，每只大鼠背部制作6处埋植区域(左右各3个)，每组2处。分别于术后3天、1周、2周、4周、6周、8周和12周，随机选取3只大鼠，行材料及其周围组织取材，常规H.E.染色、弹性蛋白染色及扫描电镜观察，分析材料的组织相容性、降解情况及对新生组织的血管化作用。 结果： 1、HHK-胶原海绵膜材料特性SDS-PAGE电泳图谱分析所抽提胶原α1(Ⅰ)带的颜色深度是α2(Ⅰ)带的2倍。Ⅰ型胶原的三条螺旋链为(2α1(Ⅰ)]α2(Ⅰ)。两次交联后的HHK-胶原海绵膜0.1-0.2cm厚，质韧，有弹性，随形性好。扫描电镜观察：粗细不等的胶原纤维呈不规则立体多孔状结构，80％的孔径平均在150-200μm。 2、HHK-胶原海绵膜的组织相容性和降解吸收 1)移植后大体观察：各组均无创口感染、组织渗液或移植物排斥反应。取材见，移植物表面包裹有薄层的纤维囊，不易与周围的纤维组织分离开。 2)移植后光镜下观察：HHK-胶原海绵和单纯胶原海绵植入早期均有较明显的炎症反应，以中性粒细胞和单核细胞为主；第2周，炎症反应明显减轻，实验组成纤维细胞增生活跃，分泌少量胶原，材料周围新生血管数量增多。HHK及胶原海绵开始降解；第6周，实验组分泌胶原纤维排列趋于整齐，表皮层愈合良好。HHK材料部分降解，胶原海绵基本消失。实验组醛复红弹性纤维染色可见细长条状弹性纤维；第12周，HHK材料完全降解。 3)电镜下观察，第2周，实验组材料周围可见胶原纤维和弹性纤维；毛小皮降解、剥离；胶原海绵膜内可见血管断面。 结论：HHK-胶原海绵复合膜组织相容性和生物降解性良好，且降解产物对机体无毒、无免疫排斥反应。 第二部分 人发角蛋白－胶原海绵－聚甲基丙烯酸羟乙酯复合生物敷料对深Ⅱ°烧伤创面的促愈作用 本实验设计将HHK－胶原海绵作为敷料内层，不用更换；将PHEMA/PD药物缓释载体膜作为敷料外层，具有保湿和缓释药物的作用可更换。通过与临床应用较广的戊二醛猪皮敷料作阳性对照，以无菌纱布作为阴性对照组，比较不同时期的创面形态学及新生组织的变化，创面愈合率及愈合时间。评价HHK-胶原海绵-PHEMA/PD复合生物敷料对深Ⅱ°烧伤创面的促愈作用及生物活性。 目的：研究HHK-胶原海绵-PHEMA/PD复合生物敷料对深Ⅱ°烧伤创面的治疗作用。 方法： 1、PHEMA的合成以丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯为甲基丙烯酸羟乙酯的反应物，以过氧化苯甲酰为引发剂，经回流、滴加等步骤完成甲基丙烯酸羟乙酯的聚合反应。将PD按一定比例溶于乙醇，与制备好的聚丙烯酸羟乙酯载体充分混匀后成膜。将PHEMA/PD膜浸泡于500ml蒸馏水中，用紫外光谱仪于5min，10min，30min，1h，2h，4h，6h……不同时间点测定浸提液中PD的含量。 2、大鼠深Ⅱ°烧伤动物模型用盛有85℃的热水，底径为1.5cm的小烧杯，紧贴于脱毛后的大鼠背部皮肤15s，制备大鼠深Ⅱ°烧伤动物模型(经病理切片证实)，以背部正中线为轴，每只大鼠左右各制作3个创面。 3、实验分组创面制备后3天，对正中线一侧的3个创面行切痂、清洗消毒处理，同时分别覆以实验组(HHK-胶原海绵-PHEMA/PD复合生物敷料)、阳性对照组(戊二醛猪皮组)和阴性对照组(无菌纱布组)的三种敷料(以后统称创面处理)，另一侧如法炮制。PHEMA/PD和无菌纱布隔日换药，观察创面肉芽组织生长情况。术后以创面完全上皮化为标准，记录创面愈合时间，于7d，14d和21d计算创面愈合率。于切痂覆敷料后1周、2周、4周、6周和8周，分别随机选取3只大鼠，切取整个创面及其周围组织，行H.E.染色形态学观察、新生血管计数、胶原纤维及弹性纤维的免疫组织化学染色观察。取标本前，将制备的胶原海绵与医用药棉分别进行断尾止血实验，分别记录止血时间及出血量，比较二者的止血效果。 4、数据分析用完全随机设计资料的方差分析方法比较3组的新生血管数和愈合时间。重复测量方差分析方法分析不同时间点的创面愈合率。用独立样本的非参数检验比较胶原海绵与医用药棉的止血时间和出血量。 结果： 1、PHEMA/PD缓释实验48小时(h)时，吸光度值最大，其后维持恒定。说明PHEMA膜在0-48h随时间推移药物PD不断释放，48h释放完全。 2、大体观察SD大鼠背部烧伤后，创口边缘的正常组织充血明显，创面轻度肿胀，无水泡，创面皮肤苍白无生机。伤后2-3日，创面坏死组织形成干硬的暗红色焦痂。2天后换敷料时，见实验组敷料均紧贴创面，湿度适宜。阳性对照组猪皮敷料仍呈灰白色，与创面贴附好，无浮动感。阴性对照组创面有少量渗血及渗液。 3、光镜下形态学观察 1)烧伤后48小时，大量组织变性坏死，表皮及毛囊上皮细胞肿胀或缺如，胞浆浓缩，核固缩，细胞界限不清。胶原纤维变性坏死，排列紊乱。 2)创面处理后2周，各组创面肉芽组织灶形成，成纤维细胞增殖活跃，并分泌较细小的胶原纤维填充创面。实验组较阳性对照组更明显，阴性对照组次之。新生组织中可见新生的毛细血管，实验组、阳性对照组较阴性对照组多(P=0.003,P=0.022P＜0.05)。 3)实验组及阳性对照组在创面处理后4周均基本愈合，阴性对照组过半例数愈合。创面肉芽组织明显增厚。新生毛细血管增殖旺盛且管腔增大，阳性对照组更明显。 4)第8周，三组创面均愈合良好。实验组及阳性对照组胶原纤维束改造塑形，无瘢痕形成趋势。阴性对照组愈合的表皮层细胞对合不好及真皮层组织排列紊乱。 4、免疫组织化学法检测 1)创面处理后2w，实验组创面真皮基质中，Ⅰ型胶原呈棕黄色细密条带状；且有少量被染成棕黄色细丝状的弹性纤维，阳性对照组不明显，阴性对照组中无弹性蛋白的阳性表达。 2)第4周，实验组及阳性对照组均可见真皮基质中呈棕黄色粗大的条带或片状的Ⅰ型胶原的强阳性表达。且实验组弹性蛋白的阳性表达较第2周时增加。 3)第6周，弹性蛋白的免疫组织化学显示，阴性对照组中仅见散在表达。 5、创面愈合时间实验组与阳性对照组平均愈合时间的差异无显著性(P=0.387P＞0.05)，而实验组和阳性对照组的愈合时间均较阴性对照组平均愈合时间短(P=0.000P＜0.05)。 6、创面愈合率实验组和阳性对照组在第14和21天的愈合率均较阴性对照组高(p=0.000P＜0.05)。实验组仅在第14天，愈合率较阳性对照组高(p=0.046P＜0.05)。 7、止血时间胶原海绵止血组的止血时间及出血量均小于医用药棉止血组(Z=-4.334P=0.000P＜0.05)(Z=-2.468P=0.014P＜0.05)。 结论：HHK-胶原海绵-PHEMA/PD复合生物敷料可能通过诱导真皮内未分化间充质干细胞分化为成纤维细胞，并活化成纤维细胞合成、分泌胶原蛋白和弹性蛋白等。刺激血管形成，在体内构建组织工程化皮肤，从而促进深Ⅱ°烧伤实验大鼠创面的愈合。若控制合成工艺，PHEMA作为药物缓释载体是可行的。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 人发角蛋白-胶原海绵复合膜的制备及其组织相容性和降解性评价

第二部分 人发角蛋白-胶原海锦-聚甲基丙烯羟乙酯复合生物敷料对深Ⅱ°烧伤创面的促愈作用

全文小结

附录一、综述：人发角蛋白的应用研究现状

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