一种胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料及其制备方法

摘要

一种胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料，属于医用高分子材料领域，该生物敷料由胶原、壳聚糖以及纳米二氧化钛复合而成，纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的1～5%；胶原和壳聚糖的重量百分比组成为：胶原50～70%、壳聚糖30～50%。本发明伤口敷料具有较好的力学性能，避免了利用交联剂带来的毒素残留和二次冻干带来的结构塌陷等问题；并且能够有效地解决伤口愈合过程中细菌感染的问题，能够给伤口愈合过程中提供一个无菌的环境。

说明书

技术领域

本发明属于医用高分子材料领域，具体涉及一种胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是细胞外基质的主要结构成分，具有卓越的生物相容性、低抗原性、高降解性、良好的止血性能和促进细胞生长和迁移等优良性能。壳聚糖是一种线性多糖，是甲壳素的脱乙酰产物，具有优异的性能，如抗菌性、血液吸收能力、生物降解性和生物相容性。胶原和壳聚糖的优良性能使其在组织工程材料方面具有广阔的应用前景。

胶原和壳聚糖分子表面有大量的亲水性基团，使由其制备的复合海绵吸水性强，伤口的渗出液容易致使复合海绵结构坍塌，其降解速率快，不利于新生表皮细胞的增殖、迁移，因此许多研究通过引入交联剂来提高胶原类海绵敷料的力学性能和稳定性，减缓其降解速率，如LieMa等人引入戊二醛来提高胶原/壳聚糖敷料的力学性能和稳定性；也有如公开号为CN103756005A的201410010048.0号专利尝试用戊二醛或者EDC来改善复合海绵的性能，虽然交联后都经蒸馏水充分水洗，但复合海绵表面的交联剂以及结合在其中的交联剂残留都会对细胞生长、增殖和迁移构成不利影响，同时容易引起伤口炎症反应，延缓伤口的愈合。

伤口表面营养丰富、湿润、温暖，给细菌的繁殖创造了一个绝佳的环境。近年来，伤口细菌感染的问题越来越严重，生命体面临着严重的威胁，因此抑制细菌的增长和繁殖也迫在眉睫。目前的抗菌剂主要可分为有机抗菌剂和无机抗菌剂，有机抗菌剂容易引起机体的抗性反应，临床医用等大多采用无机抗菌剂。无机抗菌剂主要包括离子型和光催化型两大类。离子型抗菌剂通过缓慢释放具有抗菌作用的金属离子达到抗菌作用，目前使用最广泛的是银系抗菌剂，但是此类型的抗菌剂存在成本高、易变色、防霉抗菌作用弱等不足。

与离子型抗菌剂相比，以TiO₂为代表的光催化型抗菌剂是目前更具有开发前景和研究价值的无机抗菌剂。可用于光催化抗菌剂的主要材料为n型半导体，其中TiO₂、ZnO和CdS的催化活性最高。ZnO在水中不稳定，粒子表面生成Zn(OH)₂，影响抗菌效果；而CdS在光照下不稳定，会产生有毒性的Cd²⁺。而TiO₂由于具有良好的化学稳定性和安全无毒等特性，在抗菌材料领域得到了广泛的应用。TiO₂抗菌材料可以利用光催化反应中产生的高能羟基自由基来迅速、有效地分解细菌赖以生存和生长的有机营养物质，从而达到抑制和杀菌的目的。Matsunaga等研究发现，TiO₂具有广谱抗菌的特点，对绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、芽杆菌等都有很强的杀灭能力。与普通抗菌材料相比，TiO₂光催化抗菌材料具有耐老化、耐高温、抗菌能力强和持续时间长等优点。

一般伤口的愈合周期为8～20天，烧伤或者大面积烫伤需要更长的愈合周期。在伤口愈合周期内，伤口容易感染引起伤口发炎，延缓伤口愈合时间，甚至引起机体免疫紊乱，危机生命。因此，防止伤口感染、给伤口愈合过程提供一个无菌的环境至关重要。

目前已经报道很多有关胶原与壳聚糖共混并通过冷冻干燥法制备海绵状敷料，经过生物试验检测此类创伤敷料表现出优异的修复功能，但是其抗菌效果都不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料及其制备方法。

基于上述目的，本发明采取了以下技术方案：一种胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料，该生物敷料由胶原、壳聚糖以及纳米二氧化钛复合而成，所述纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的1～5%；胶原和壳聚糖的重量百分比组成为：胶原50～70%、壳聚糖30～50%。

所述胶原的分子量为200～300KDa。

所述胶原采用酸-酶结合法从猪皮中提取而得。

所述壳聚糖的脱乙酰度≥90%，有利于提高敷料的力学性能。

所述纳米二氧化钛为锐钛矿型，其平均粒径为20～30nm，锐钛矿型纳米二氧化钛具有很好的光催化效果，可以抑制细菌生长和病毒的活性，具有杀菌、除臭、防霉的效果。

所述胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料的制备方法，包括以下步骤：

1）将胶原和壳聚糖溶于醋酸溶液中分别得到胶原溶液和壳聚糖溶液；

2）将壳聚糖溶液、胶原溶液混合得到胶原/壳聚糖混合液；

3）利用溶胶-凝胶技术制备纳米二氧化钛水溶胶；

4）将纳米二氧化钛水溶胶加入到胶原/壳聚糖混合液中后，除泡，于0～8℃下放置8～12h后，冷冻干燥即得。

步骤1）中所述醋酸溶液的浓度为0.01～0.5M，所述胶原溶液的浓度为5～15g/L；所述壳聚糖溶液的浓度为5～15g/L。

所述步骤4）采用真空除泡法除泡；冷冻干燥的温度为-90～-30℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1）本发明敷料安全、抗菌效果好，具有良好的生物相容性，且力学性能及稳定性能强，避免了采用交联剂交联法所带来的毒素残留和二次冻干带来的结构塌陷等问题；伤口敷料的坍塌主要是由于其中分子间的键合作用比较弱，遇到极性强的水，很容易坍塌，而纳米二氧化钛能够与胶原、壳聚糖产生氢键结合，从而改善敷料的力学性能，纳米二氧化钛刚好弥补了这一点。

2）本发明制备方法简便可行，条件温和，采用酸-酶结合法保证了胶原蛋白保持较好的天然生物活性，制得的产品具有良好的生物相容性。利用溶胶-凝胶技术制备的纳米二氧化钛粒径分布均一（20～30nm），且表面还有大量的羟基基团，而胶原和壳聚糖分子上也有大量的羟基、氨基基团，胶原/壳聚糖混合溶液中加入纳米二氧化钛水溶胶，纳米二氧化钛能够和胶原、壳聚糖之间形成较强的氢键作用，增强海绵敷料整体的力学性能，避免引入化学交联剂（如戊二醛、EDC等）带来的毒性残留问题。

3）本发明采用溶胶-凝胶技术制备纳米二氧化钛水溶胶，制得的纳米二氧化钛晶型为锐钛矿，经抗菌试验检测，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌具有较强的抗菌杀菌效果，能够保证伤口敷料具有长效抗菌性能，在伤口愈合过程中给伤口提供一个无菌的环境。同时，改变了以往纳米粒子混入复合体的方法，将制备的纳米二氧化钛水溶胶掺入其中，避免了纳米粒子掺入混合体过程中纳米粒子团聚的现象，能够保证纳米二氧化钛在胶原/壳聚糖溶液及敷料体系中较好的分散性。

附图说明

图1是实施例1制得纳米TiO₂粉末的XRD谱图；

图2样品0、样品1、样品2、样品3、样品4（从左至右）的数码照片图；

图3是样品0、1、2、3、4断面的扫描电镜照片；

图4是样品3（CCS-5%）的EDS能谱图；

图5是胶原（Col）、壳聚糖（CS）、纳米TiO₂以及样品0和样品3的红外谱图；

图6是胶原（Col）、壳聚糖（CS）以及样品0、1、2、3、4经溶菌酶降解实验结果；

图7是样品0、1、2、3、4抑菌圈实验结果；

图8是样品0、1、2、3、4抑制金黄色葡萄球菌生长的扫描电镜（SEM）图；

图9是样品3的红细胞聚集的扫描电镜（SEM）图（×400）；

图10是样品0、1、2、3、4促进红细胞聚集的SEM图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。

实施例1纳米TiO₂水溶胶的制备及性能分析

1.1纳米TiO₂水溶胶的制备方法：本发明针对用于胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料的需要，经过大量试验，优化了利用溶胶-凝胶技术制备纳米二氧化钛水溶胶的方案。为了便于分析和比较，以下实施例中所指纳米二氧化钛水溶胶的制备均由以下方法制得：取一定摩尔比例的钛酸四丁酯、水、乙醇和浓盐酸（0.5～2:100～300:10～20:0.5～1）；先将水和浓盐酸均匀混合于单口烧瓶中，45℃高速磁力搅拌；然后将钛酸四丁酯和乙醇均匀混合，用浓盐酸调pH=2，于恒压滴液漏斗中以1d/2s的速率均匀滴加入单口烧瓶中；40℃保温，继续磁力搅拌2h，得到淡蓝色透明纳米二氧化钛水溶胶。

1.2粒径和晶型分析

将所得纳米二氧化钛水溶胶进行干燥，对得到的TiO₂粉末进行XRD扫描，结果见图1。

通过图1不同的衍射峰的位置，可以判断纳米TiO₂的晶型，从图1中可以明显看到在衍射角25°左右有明显的衍射峰，参照粉末衍射标准委员会提供的标准PDF卡片可以确定所制备的纳米TiO₂为锐钛矿型。

利用激光粒度分析仪对制得的纳米二氧化钛水溶胶进行粒径分析，所得粒径粒子分布主要集中在20～30nm。

实施例2纳米二氧化钛加入量对海绵生物敷料性能的影响

2.1不同纳米二氧化钛含量的海绵生物敷料的制备

其制备方法为：

1）分别将胶原和壳聚糖溶于0.5M的醋酸溶液中得到5g/L胶原溶液和5g/L壳聚糖溶液；

2）将壳聚糖溶液和胶原溶液按壳聚糖和胶原质量比1：1混合得到胶原/壳聚糖混合液；

3）利用溶胶-凝胶技术制备纳米二氧化钛水溶胶，具体步骤同实施例1中的1.1。

4）分别按纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的1%、3%、5%、7%的比例，将纳米二氧化钛水溶胶加入到胶原/壳聚糖混合液中后，真空除泡，于4℃下放置12h后，-90～-30℃冷冻干燥12h得到样品1（CCS-1%）、样品2（CCS-3%）、样品3（CCS-5%）、样品4（CCS-7%），同时将不加纳米二氧化钛水溶胶的做空白试样记为样品0（CCS），图2为样品0、1、2、3、4（从左至右）的数码照片图，然后对各样品进行断面扫描电镜观察、红外光谱分析，同时还对其溶胀性能、孔隙率、力学性能、透气性能、降解性能、抗菌性能、红细胞聚集及细胞毒性进行研究，下面是对实验结果进行的分析。

2.2微观形貌

图3是样品0、1、2、3、4的断面扫描电镜照片。从图3中可以看出，样品1-样品4都表现出片层多孔的花朵状结构，且孔径分布比较均匀，孔径之间的片层相互连接，这种特殊的结构有利于细胞的粘附、增殖、生长和迁移。随着不同百分含量纳米TiO₂的加入，各样品的三维多孔结构没有明显的变化，说明纳米TiO₂对多孔支架的片层结构影响不大，但其孔径结构逐渐变得均匀，孔径密度逐渐增大。当纳米TiO₂含量达到5%时，多孔支架的孔径和孔隙率达到最优；当纳米TiO₂含量达到7%时，多孔支架的片层结构发生部分堆积，孔径减小。同时，从图3-4可以明显看到部分片层结构坍塌，这可能是由于纳米TiO₂的团聚所导致，这不利于细胞的粘附、增殖、生长和迁移。

同时本发明还对得到的样品做了EDX元素分析，分析报告显示纳米TiO₂负载在多孔支架中，图4是样品3的EDX能谱图。

2.3红外光谱

图5是胶原（Col）、壳聚糖（CS）、纳米TiO₂以及样品0和样品3的红外谱图。对比胶原、壳聚糖、纳米TiO₂的红外谱图，在样品3的红外谱图中，1560cm^-1附近的酰胺II带发生了红移，说明胶原和壳聚糖分子之间形成了氢键作用；1455cm^-1、1336cm^-1、1278cm^-1和1204cm^-1四处决定胶原三股螺旋结构的吸收峰明显减弱甚至消失，这也说明胶原与壳聚糖分子之间发生了较为强烈的作用，消弱了胶原三股螺旋结构中胶原分子链之间的相互作用；在550cm^-1处出现了新的吸收峰，说明纳米TiO₂与胶原和壳聚糖之间产生了氢键作用，同时纳米二氧化钛1600cm^-1和1200cm^-1处吸收峰的消失也证明了纳米TiO₂与胶原、壳聚糖之间发生了较为强烈的作用，在3400cm^-1附近吸收峰变宽，也说明纳米TiO₂表面的羟基基团与胶原、壳聚糖之间形成较为强烈的氢键作用。

2.4溶胀性

为了避免创面分泌液的过度积累和脱水，理想的伤口敷料应能够控制水分流失比率，这就要求伤口敷料必须有一定的溶胀能力和保水能力。较高的溶胀性能不仅能避免分泌液的过度积累导致伤口感染发炎，同时可以作为营养物质的传输通道给细胞提供营养，从而利于细胞的迁移和生长，加速伤口的愈合。

对样品0、1、2、3、4进行溶胀实验，具体是将样品0-4经过PBS溶液完全浸泡24h后，对各样品的溶胀率进行计算，其结果见表1所示，从表1可知，经过PBS溶液24h的完全浸泡，胶原/壳聚糖（样品0）的溶胀率达到715%，随着纳米TiO₂的增加，溶胀率逐渐增大，最高达到925%。当纳米TiO₂的含量达到7%时，其溶胀率有一定的下降，原因可能是纳米TiO₂颗粒表面含有大量的羟基，当纳米TiO₂含量增大时可能出现团聚，使纳米TiO₂表面的氢键不能很好地和胶原、壳聚糖形成键合作用，从而出现内部坍塌收缩，导致伤口敷料溶胀性能的下降。

表1经过PBS溶液完全浸泡24h后各样品的溶胀率

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2.5孔隙率

对样品0、1、2、3、4的孔隙率进行测定，其测定方法参照文献“ChenG,UshidaT,TateishiT.Scaffolddesignfortissueengineering.MacromolBiosci2002;2:67–77.”。

众所周知，生物材料的孔隙大小、孔隙形状以及孔隙率等都对细胞的粘附与增殖有很大影响，同时影响着其器官的功能表达，对组织修复具有很大影响。因此，保证合适的孔隙率大小也是决定伤口敷料促进伤口愈合的一个重要条件。其结果如表2所示，从图2可以看到，样品0的孔隙率为82.07%，随着纳米TiO₂含量的增加，其孔隙率逐渐增大，且在纳米TiO₂含量为5%时（样品3）达到最大。孔径大小、孔径分布和孔隙率决定着多孔敷料的力学性能和溶胀性能。合适的孔径大小、分布和孔隙率能够保证细胞在多孔敷料中粘附、增殖、生长和迁移。本发明敷料的孔隙率达到88%～95%，能保证细胞在多孔敷料中粘附、增殖、生长和迁移。

表2样品0、1、2、3、4的孔隙率

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2.6力学性能

抗拉强度也是多孔海绵敷料的一个重要指标，抗拉强度的高低决定了其在组织工程、伤口敷料等领域的应用广度。太低的抗拉强度不能保证伤口敷料的形貌，很容易破损，不利于伤口的愈合。

对样品0、1、2、3、4的力学性能进行测试，其测试方法参照文献“MandalA,SekarS,ChandrasekaranN,etal.Synthesis,characterizationandevaluationofcollagenscaffoldscrosslinkedwithaminosilanefunctionalizedsilvernanoparticles:invitroandinvivostudies[J].JournalofMaterialsChemistryB,2015,3(15):3032-3043.”，其结果见表3所示。

表3样品0、1、2、3、4的力学性能测试结果

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表3是样品0、1、2、3、4的力学性能测试结果，由表3可知，随着纳米TiO₂含量增加，敷料整体的抗拉强度逐渐提高，当纳米TiO₂添加比例达到5%时，其抗拉强度为1.6MPa，但当纳米TiO₂添加比例达7%时，敷料的抗拉强度下降为1.0MPa，这可能是由于过多的纳米TiO₂不能与胶原、壳聚糖之间形成键合作用，自身发生了强烈的氢键作用，形成团聚，导致复合敷料力学性能的下降。

2.7透气性

透气性是衡量伤口敷料好坏的重要指标，良好的透气性能可以保证伤口表面通畅的气体交换，有利于表皮细胞的粘附、增殖、生长和迁移，同时有利于伤口渗出液的挥发，减少伤口发炎的几率。

对样品0、1、2、3、4进行透气性测试，其测试方法参照国标YY/T0471.2-2004，其结果见表4所示，从表4可以看出，样品0的水蒸气透过率达到3500g·m^-2·24h^-1，随着纳米TiO₂添加比例的增大，其水蒸气透过率有一定的下降，但下降的幅度不是很大，均在3000g·m^-2·24h^-1附近，当纳米TiO₂添加比例达到7%时，其伤口敷料的水蒸气透过率最低，为2900g·m^-2·24h^-1，均能满足伤口敷料的透气性要求。

表4样品0、1、2、3、4的透气性测试结果

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2.8降解性

对胶原（Col）、壳聚糖（CS）以及样品0、1、2、3、4进行溶菌酶降解实验，分别记录1、2、3、4周后各样品剩余量占初始量的百分比，其结果见图6所示，

从图6可知，经过4周的降解，纯胶原降解了将近一半，剩余的胶原重量占初始量的55%，纯壳聚糖与胶原/壳聚糖（样品0）的剩余重量均占初始量的69%，样品1、2、3、4均占初始量的75%。胶原与壳聚糖复合后（样品0）能够明显地降低胶原的降解率，特别是在第1周和第2周，样品0的剩余量为82%，而胶原的剩余量为65%，这要归功于壳聚糖的抗酶解性以及壳聚糖与胶原之间形成的稳定的键合作用。随着不同比例的纳米TiO₂（1%、3%、5%、7%）的加入，胶原/壳聚糖复合海绵的降解率都有一定的下降，这是因为纳米级的TiO₂水溶胶表面具有大量的羟基，进入到胶原与壳聚糖分子之间，与胶原、壳聚糖未反应的羟基、氨基和羧基之间形成较为稳定的氢键，增加了胶原、壳聚糖分子间的作用，提高了胶原/壳聚糖复合物的稳定性。当纳米TiO₂的比例提高到7%时，胶原/壳聚糖/纳米TiO₂多孔海绵的稳定性低于含5%纳米TiO₂的，这可能是由于在共混的过程中，由于纳米TiO₂较多，纳米TiO₂分子之间形成了较为强的氢键作用，减少了其与胶原、壳聚糖分子之间形成氢键的几率，从而降低了胶原/壳聚糖复合物整体的稳定性。

2.9抗菌性能

2.9.1对大肠杆菌的抑菌抗菌实验

采用抑菌圈法评价了样品0、1、2、3、4对大肠杆菌的抑菌抗菌效果。具体操作是将各样品放置于培养了大肠杆菌的培养皿，在37℃恒温恒湿培养箱中培养24h后得到的结果，如图7所示。由图7可见，随着纳米TiO₂含量的增加，抑菌圈逐渐增大，说明添加纳米TiO₂的复合敷料对大肠杆菌具有明显的抑制作用，且随着纳米TiO₂浓度的提高，其抑制作用也越来越强。

2.9.2对金黄色葡萄球菌的抑菌抗菌实验

方法如下：①将各测试样品剪切成0.5cm×0.5cm的正方形，置于紫外灯下照射30min，充分灭菌处理。②在无菌操作台中，将灭菌后的样品置于24孔培养板中，加入0.5ml金黄色葡萄球菌菌液和0.5ml生理盐水，于室温下静置培养2h。③轻轻用生理盐水将样品表面多余的金黄色葡萄球菌菌液洗去，空气中干燥0.5h。然后将样品置于37℃恒温恒湿箱中培养24h。④从恒温恒湿箱中取出样品，用2.5%戊二醛溶液固定2～3h。⑤用乙醇溶液干燥样品，然后喷金处理于扫描电镜（SEM）下观察拍照。结果如图8所示。

由图8可见，未添加纳米TiO₂的胶原/壳聚糖（样品0）伤口敷料表面有大量金黄色葡萄球菌菌落的生成，说明胶原/壳聚糖伤口敷料对金黄色葡萄球菌没有明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的生长没有太大的影响。添加纳米TiO₂的试验组（样品1、2、3、4）对金黄色葡萄球菌表现出良好的抑制作用，从图8中还可以看出单个金黄色葡萄球菌的直径为1μm左右，随着纳米TiO₂含量的增加，金黄色葡萄球菌菌落数逐渐减少，这说明纳米TiO₂对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，添加纳米TiO₂后能够给伤口提供一个清洁无菌的愈合环境。

2.10红细胞聚集分析

在止血机理的研究中，血小板的粘附、聚集以及形成血栓是其重要的内容。胶原不仅能够给血小板提供多种附着位点，同时能诱导血小板颗粒内容物的释放，刺激机体产生凝血酶因子，进而生成凝血蛋白，包裹血小板和红细胞，形成血栓堵以住伤口破损处。

壳聚糖的止血机理与胶原不同，它的止血机理不是依赖常规的血小板和凝血因子的瀑布机制。在壳聚糖的止血机理中，最重要的一环是依靠与红细胞发生粘附聚集，进而使血液快速凝固达到止血的目的。

红细胞聚集分析方法：

（一）光学显微镜观察

方法：1）分别取100mg的样品0、1、2、3、4溶于10ml1%的醋酸溶液中，振荡使其充分溶解，直至溶液呈透明状；

2）取上述溶液10ml于载玻片上，向载玻片添加50ml的红细胞（RBC），用移液枪枪头拨动，使红细胞与各样品溶液充分混合均匀，添加少许生理盐水稀释混合溶液，于光学显微镜下观察红细胞在不同时间段的聚集状态形态；由于样品0、1、2、3、4表现基本没有什么差别，因此只附上样品3的红细胞聚集光学显微镜照片进行说明，如图9所示。

（二）扫描电镜观察

方法：将样品0、1、2、3、4剪切成0.5cm×0.5cm的正方形结构置于24孔板中，在室温下加入0.5mlRBC和0.5ml的生理盐水，静置培养2h，然后用生理盐水轻轻地将样品表面的RBC洗去，空气中干燥0.5h，再取少量的2.5%戊二醛溶液固定2～3h，随后用乙醇溶液干燥，最后喷金处理后，于扫描电镜（SEM）下观察红细胞的状态。

结果分析：图9为样品3不同时间段红细胞聚集状态的扫描电镜照片。0min时，可以清楚地看到单个的红细胞，此时红细胞呈现游离状态，到10min时，单个游离的红细胞逐渐出现粘附聚集，此时边缘处还能观察到单个游离的红细胞，到30min时，红细胞基本上粘附聚集在一起，细胞之间紧密连接，形成块状或片状的结构，说明胶原/壳聚糖/纳米TiO₂多孔支架对红细胞的聚集具有良好的促进作用。

图10为样品0、1、2、3、4促进红细胞聚集的SEM图。从图10可以看出，加入纳米TiO₂后，红细胞之间紧紧地粘附聚集在一起，呈现出团簇状，有利于在伤口处形成血栓堵住伤口，达到止血的目的。比较样品1、2、3、4表面红细胞的聚集状态，可以看出纳米TiO₂的含量对红细胞的聚集状态影响不大。

因此，本发明的生物敷料有利于伤口血管中红细胞的聚集，且纳米TiO₂的含量不影响敷料对红细胞的聚集作用，有利于加速伤口止血，促进伤口愈合。

2.11细胞毒性分析

细胞毒性是衡量伤口敷料生物相容性的重要指标之一。低细胞毒性的伤口敷料有利于成纤维细胞在其表面粘附、增殖、生长和迁移，加快伤口的愈合速度。

按照ISO/TC194文件对样品0、1、2、3、4进行细胞毒性（cytotoxicity）评定。评定结果见表5和表6所示，其评定标准见表7所示。

从表5和表6可以看到，培养1天的不同实验分组之间的细胞OD值之间差异不大，且细胞相对增殖率（RGR）均在90%以上，细胞毒性等级为0级或I级；培养3天的不同实验分组之间的细胞OD值存在较大的差异，CCS-7%组（样品4）的细胞相对增殖率最低，为76.2%，参照细胞毒性分级，实验组细胞相对增殖率均大于75%，其细胞毒性等级均在I级以上，且CCS-1%组（样品1）在培养1天和3天均表现出良好细胞相对增殖率，而其他实验组培养3天后的细胞相对增殖率均有不同程度的下降，但都满足无细胞毒性或低细胞毒性的要求。可见，结果添加纳米TiO₂的比例对胶原/壳聚糖/纳米TiO₂伤口敷料的细胞毒性影响不大，各个比例的伤口敷料均表现出良好的细胞相容性。

表5胶原/壳聚糖/纳米TiO₂伤口敷料的细胞相对增殖率和相应毒性等级（1天）

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表6胶原/壳聚糖/纳米TiO₂伤口敷料的细胞相对增殖率和相应毒性等级（3天）

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表7细胞毒性评价标准

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实施例3

一种胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料，该生物敷料还包括纳米二氧化钛，纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的5%；胶原和壳聚糖的重量百分比为：胶原70%，壳聚糖30%。胶原的分子量为200～300KDa。胶原采用酸-酶结合法从猪皮中提取而得。壳聚糖的脱乙酰度为90%。纳米二氧化钛的平均粒径为20～30nm。

胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料的制备方法，包括以下步骤：

1）分别将胶原和壳聚糖溶于0.5M的醋酸溶液中得到5g/L胶原溶液和5g/L壳聚糖溶液；

2）将壳聚糖溶液和胶原溶液按胶原和壳聚糖质量比7：3混合得到胶原/壳聚糖混合液；

3）利用溶胶-凝胶技术制备纳米二氧化钛水溶胶，具体制备方法为：取水和浓盐酸混合得A液；取钛酸四丁酯和乙醇混合，调pH=2得B液，将B液在40℃下以1d/2s的速度滴加到A液中，搅拌2h即得淡蓝色透明纳米二氧化钛水溶胶，所述钛酸四丁酯、水、乙醇和浓盐酸的摩尔比为0.5～2:100～300:10～20:0.5～1；

4）按纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的5%的比例，将纳米二氧化钛水溶胶加入到胶原/壳聚糖混合液中后，真空除泡，于4℃下放置8h后，-90～-30℃冷冻干燥12h即得。

实施例4

一种胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料，该生物敷料还包括纳米二氧化钛，纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的3%；胶原和壳聚糖的重量百分比为：胶原60%，壳聚糖40%。胶原的分子量为200～300KDa。胶原采用酸-酶结合法从猪皮中提取而得。壳聚糖的脱乙酰度为95%。纳米二氧化钛的平均粒径为20～30nm。

胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料的制备方法同实施例3，不同的是，步骤1）中醋酸溶液的浓度为0.01M；胶原溶液和壳聚糖溶液的浓度为15g/L；步骤2）中将胶原溶液和壳聚糖溶液按胶原和壳聚糖质量比6：4混合；步骤4）中纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的3%。

实施例5

一种胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料，该生物敷料还包括纳米二氧化钛，纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的1%；胶原和壳聚糖的重量百分比为：胶原55%，壳聚糖45%。胶原的分子量为200～300KDa。胶原采用酸-酶结合法从猪皮中提取而得。壳聚糖的脱乙酰度为90%。纳米二氧化钛的平均粒径为20～30nm。

胶原/壳聚糖复合海绵生物敷料的制备方法同实施例3，不同的是，步骤1）中醋酸溶液的浓度为0.05M；胶原溶液和壳聚糖溶液的浓度为10g/L；步骤2）中将壳聚糖溶液和胶原溶液按胶原和壳聚糖质量比5.5：4.5混合；步骤4）中纳米二氧化钛占胶原和壳聚糖总重的1%。