胸腺修饰诱导猪同种心脏移植免疫耐受及期间细胞流变学特性变化的实验研究

摘要

背景及目的：经过多年基础研究和临床实验，同种原位心脏移植已成为一种应用于临床治疗终末期心脏病的有效方法。目前，供心保存、外科手术技术、术后感染已不再是阻碍心脏移植成功的最主要因素。但心脏移植术后的排斥反应、长期应用免疫抑制剂所引起的并发症及昂贵的医疗费用都是亟待解决的问题。同时，同种异基因器官供体远远不能满足临床的需求量。异种移植有可能解决这一矛盾，但目前的免疫抑制方案仍不足以阻止异种器官的排斥，单纯增加免疫抑制剂的剂量不可能保证成功的异种移植。因此，如何有效地诱导供体特异性的免疫耐受便成为解决上述问题的关键。 胸腺修饰这一诱导方法已经在大鼠的心脏移植、肾移植以及胰腺移植研究中获得很大进展。然而，很多实验观察到即使成功诱导免疫耐受，还是会出现一定程度的排斥反应，有学者认为这种现象可能与受体照射或药物处理后残存体内的淋巴细胞有关，如何清除这些细胞可能是诱导免疫耐受的关键。 同时，这一研究领域中，有关大动物的实验报道甚少，对于动物免疫耐受诱导的研究较多，但啮齿类动物血管内皮不表达MHC类抗原，其同种急性排斥反应的机制与人类有很大不同，其程度也相对较轻。并且，从临床应用前景考虑，大动物模型的实验研究也应受到更多的重视。许多研究表明，在同种心脏移植排斥反应过程中可见红、白细胞聚集于心肌细胞和血管内皮细胞周围，血管内大量红细胞聚集，白细胞和血小板附壁，血管腔隙变窄堵塞等微循环障碍。这些现象提示红细胞、白细胞流变学特性改变是与同种移植排斥反应及移植物失功相伴随的关键因素之一。而细胞流变学在急性排斥反应期间扮演的确切角色及其发生机制目前尚不清楚。 因此，本实验选择猪作为实验对象，先用X线照射破坏受体的免疫系统，然后采用胸腺注入供体脾细胞诱导免疫耐受，并于稍后静脉输注供体淋巴细胞刺激受体残存淋巴细胞发生凋亡，再行异位心脏移植，观察移植心存活时间，检测混合淋巴细胞反应，来确定免疫耐受是否发生及其程度，探寻大动物免疫耐受模型的诱导方式，为进一步的异种心脏移植研究打下基础。并观察这一期间红、白细胞流变学特性的改变及其变化规律，进一步探讨和验证其与急性排斥反应的关系。 课题研究分为以下三个部分： 第一部分：建立猪腹部心脏移植动物模型方法： 1．分组：供体，三元杂猪28只；受体，二元杂猪28只。共进行移植手术28例，其中正式实验23例，预实验5例。 2．动物模型制作：以Ono术式为基础，局部加以改进，将供心的升主动脉和肺动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静脉行端侧吻合，制作猪腹腔同种异位心脏移植模型。 结果： 预实验5例，移植心存活超过3天的有2例。其他3例具体情况如下：术中受体追加麻药过量死亡1例；血管吻合开放后心脏不复跳2例。 正式实验23例，其中20例移植心均存活3天以上；有2例移植心未复跳；1例术后出血，于移植术后第1天死亡。 第二部分：胸腺修饰诱导猪心脏移植免疫耐受的实验研究方法： 1．分组 共分四组，每组供受体各5头： 空白组一受体不作任何处理，接受心脏移植； 对照组一受体接受2Gy剂量X线全身照射后2周行心脏移植； 实验A组一受体接受2Gy剂量X线全身照射的当天，进行胸腺内注射供体脾细胞，2周后行心脏移植； 实验B组一受体接受2Gy剂量X线全身照射的当天，进行胸腺内注射供体脾细胞，1周后静脉注射供体淋巴细胞，2周后行心脏移植。 2．照射后实验动物不良反应的观察。 3．照射后受体淋巴细胞总数的变化。于受体猪接受照射前1天，照射后第1、3、7和14天检测淋巴细胞总数。 4．移植心存活时间的观察。 5．混合淋巴细胞反应的检测。 于受体猪接受照射前1天，照射后第1周和第2周分别采供体静脉血2ml、受体静脉血2ml，行单向混合淋巴细胞培养，检测其刺激效应。 6病理学检查：心脏停跳后切取部分心肌，进行心肌组织病理学检查，并进行排斥反应病理分级。7．统计学方法：均采用均数±标准差(X±SD)表示，应用SPSS13.0软件进行统计学分析，采用One-Way ANOVA、重复测量数据的方差分析检验方法。P<0.05为存在显著性差异。 结果： 1．照射后不良反应观察对照组照射后2例出现呕吐，1例出现拒食；实验A组1例呕吐，1例拒食；实验B组1例呕吐，1例耳后出现淤斑。 2．照射前后淋巴细胞总数的变化各组照射后第2天淋巴细胞总数最低，2周后恢复至照射前的30％～40％。 3．移植心存活时间空白组平均存活4.2天，对照组平均存活4.6天，实验A组平均存活7.6天，实验B平均存活9.6天。空白组与对照组移植心存活时间无显著差异，实验A组与空白组及对照组比较均有显著性差异(分别为P=0.001，P=0.003)，实验B组与空白组及对照组比较同样有显著性差异(P=0.000)，实验A组与实验B组差异具有显著性意义(P=0.036)。 4．MLR检测同一时间点内，在照射前及预处理后1周各组间均无显著性差异(P>0.05)；预处理后2周实验A组及实验B组较对照组均有显著性差异(P=0.000)，实验A组与实验B组之间的差异亦存在显著性意义(P=0.002)。重复测量统计，组间效应比较说明预处理方法的不同对淋巴细胞反应的影响有显著性意义(F=6.065，P=0.015)；各时间点与预处理方法存在交互效应(F=13.039，P=0.001)，重复因素各时间点间存在显著性差异(113.897，P=0.000)；多重比较说明单纯照射(对照组)后各时间点MLR无显著性差异(P>0.05)，实验A组(P<0.05)及实验B组(P=0.000)预处理后2周较照射前MLR均有显著性差异，实验B组预处理后2周较预处理后1周MLR之间的差异有显著性意义(P=0.000)。5．移植心病理学检查停跳后各组移植心病理学检查均为4级排斥反应。 结论： 1、胸腺修饰抗原量采用供体脾细胞10×10<'7>个/kg达到了一定效果。 2、2Gy低剂量X射线照射对受体外周淋巴细胞的清除是有效的。 3、单纯X射线照射无法诱导有效的移植免疫耐受。 4、受体猪全身照射后单纯胸腺修饰可诱导一定程度的免疫抑制。 5、受体猪全身照射后，胸腺修饰联合静脉注射供体淋巴细胞诱导的免疫抑制程度较单纯胸腺修饰进一步加深，但并未诱导出小动物实验表现出的“永久性”免疫耐受。 第三部分：免疫耐受诱导期间细胞流变学特性的改变方法： 1．分组：同第二部分。 2．标本采集：在受体猪照射前1天、照射后第1、7、14天及移植术后1、3、5、7、9天抽取静脉血6ml检测。 3．红、白细胞流变学特性检测：测定红细胞聚集指数(erythrocyte aggregation index，EAI)、红细胞变形指数(erythrocyte deformability index，EDI)及白细胞变形指数(leucocyte deformability index，LDI)。 4．实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学处理，以P<0.05为具有统计学意义界限。各组流变学参数行重复测量数据的方差分析并行多重比较(LSD检验)。结果： 1．空白组及对照组在术前各时间点与照射前无显著差异，术后早期即出现红细胞聚集指数持续升高，红、白细胞变形性则持续下降； 2．实验A组细胞流变学特性开始显著恶化则发生在术后第5天； 3．实验B组则进一步延后，在术后第9天红细胞聚集性升高，细胞变形性显著下降。 结论： 1、在猪同种心脏移植急性排斥反应期间，红细胞聚集性持续升高、红白细胞变形性持续下降。 2、X射线照射可引起早期白细胞变形性的下降，但持续时间较短。对红细胞聚集性及变形性则无显著影响。 3、实验组术后有效免疫抑制期间并未出现显著的细胞流变学改变；而当临近移植心存活终末期时，红细胞聚集性持续升高，红、白细胞变形性持续下降，预示了严重急性排斥反应的即将发生。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分：建立猪腹部心脏移植模型实验

背景及目的

实验材料和方法

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

参考文献

第二部分：胸腺修饰诱导大动物心脏移植免疫耐受的实验研究

研究背景及实验目的

实验材料和方法

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结 论

参考文献

第三部分：免疫耐受期间血液细胞流变学特性的变化

研究背景及实验目的

实验材料和方法

实验材料

实验方法

结 果

讨论

结论

参考文献

全文结论

附录

致谢