糖尿病性勃起功能障碍大鼠模型的建立及阴茎海绵体组织nNOS的变化

摘要

研究背景 阴茎勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是一种常见病、多发病，全世界约有1.5亿男性患有不同程度的勃起功能障碍，在流行病学调查中，人们发现ED是男性糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者常见的慢性并发症之一。近年来，随着人们生活水平的提高，糖尿病(DM)的发病率有逐年上升的趋势，根据预测，到2010年，全球DM患者将达到2亿1千万，在中国，DM的患病人口为2000万～4000万<'[1]>。DM并发症对人类健康的危害大而备受关注，其心血管、肾脏、视网膜等并发症的研究较早且取得不少进展，而DM患者并发勃起功能障碍(ED)近年来才逐渐被人们重视，DM的并发症之中，ED发生较早，国外报道DM人群中ED的发生率一般为50％，DM性ED的发生率比非DM性患者高2～5倍，且随年龄的增长和病程的延长发生率明显增加。因此，对其病因机制的探讨可为临床治疗提供理论依据和指导意义，而建立DM性ED动物模型是进行该病基础研究的必备条件。 阴茎勃起是由神经内分泌调节下阴茎动脉和阴茎海绵体一系列血液动力学变化的过程。当性刺激时，副交感神经、非肾上腺素非胆碱能神经末梢和血管内皮细胞，在一氧化氮合成酶(NOS)的作用下释放一氧化氮(nitric oxide，NO)，NO使环磷酸鸟苷活性增加，GTP转化成cGMP，cGMP使细胞浆内钙离子浓度降低，使平滑肌松弛，阴茎血流量增加而诱发勃起，cGMP又被磷酸二酯V型(PDE5)所水解而灭活。NO-cGMP通路在阴茎勃起过程中起着重要的调控作用，NOS自然成为这一通路中的关键酶。NOS广泛存在于各种类型细胞中，现已确定的NOS亚型有3种，根据原型酶的细胞或组织来源不同，分别称为脑神经元型NOS(nNOS)、内皮细胞型NOS(eNOS)和白细胞或巨噬细胞型NOS(iNOS)，这3种亚型的NOS总的来讲从功能上可分为两大类，即原生型NOS(eNOS，包括nNOS和eNOS)和诱导型NOS(iNOS)。原生型NOS分布于血管内皮细胞、神经组织和血小板中，该酶为可溶性酶，它的合成受Ca<'2+>和cAMP的调节，任何引起Ca<'2+>进入细胞的因素均能导致cNOS活性增加。当胞浆内Ca<'2+>浓度达到0.4～1μmol/L时该酶活性最大。它被激活时，NO释放的时间短，其中cNOS产生的NO更接近血管平滑肌，它可以激活血管平滑肌细胞中的可溶性鸟苷酸环化酶，使胞内cAMP浓度升高，从而起到扩张血管、抑制血小板和白细胞粘附、聚集的作用，发挥生理功能。 在阴茎组织中，存在两种类型的NOS，即nNOS和eNOS，其中nNOS催化L-精氨酸生成的NO是阴茎组织中NO的主要来源。 糖尿病可以导致阴茎海绵体NO-cGMP通路发生变化。NO化学性质不稳定，半衰期极短，它在激活鸟苷酸环化酶后5s内即转化为硝酸盐和亚硝酸盐，因而很难直接了解其局部含量。目前研究主要从NO介导的离体阴茎海绵体的舒张反应间接检测海绵体NO的变化。多个实验发现糖尿病动物离体阴茎海绵体内皮依赖性及非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经源性舒张反应受损，认为局部NO水平降低是离体阴茎海绵体舒张反应受损的直接原因。糖尿病引起阴茎海绵体局部NO水平降低，主要是通过降低一氧化氮合酶(NOS)的活性介导的。 目的 探讨糖尿病性勃起功能障碍大鼠模型的建立及其(DM&ED)发病机理。 探讨链脲佐菌素诱导糖尿病性大鼠ED模型建立的条件，以及成模大鼠阴茎海绵体组织中神经元性NOS表达活性，以及大鼠阴茎海绵体神经组织、平滑肌细胞显微及超微结构的改变。 方法 1．糖尿病勃起功能障碍大鼠模型的建立：24只SD大鼠，随机分为4组，分别为对照组(不注射STZ)、注射STZA0 mg/kg组、注射STZ60mg/kg组、注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液组，每组6只，禁食12h后，按不同处理因素即给予大鼠腹腔注射STZ，分别记录4 d、1周、2周、3周的体质量、阿朴吗啡(APO)诱导阴茎的勃起次数及空腹血糖。按重复测量数据的方差分析处理数据。 2．糖尿病勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体组织nNOS变化的研究： (1)糖尿病勃起功能障碍大鼠模型的筛选标准在第一步利用链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病及糖尿病性勃起功能障碍模型实验中，得到糖尿病成模STZ最佳注射剂量应为60mg/kg，APO诱导大鼠勃起的最佳剂量应为100mg/kg。筛选糖尿病ED模型的时间应定在注射STZ后的2周左右。在本实验的前期工作中，我们对SD大鼠空腹血糖进行测试，得出SD大鼠空腹血糖95％正常参考值范围：4.0～7.2mmol/L。因此，在大鼠注射STZ后两周，血糖>7.2 mmol/L，及APO诱导未出现阴茎勃起的，可以认为是糖尿病性勃起功能障碍模型(DM&ED group)；血糖>7.2 mmol/L，但APO诱导出现阴茎勃起的大鼠，被认为是糖尿病性非勃起功能障碍模型(DM group)，如果此后该组中有大鼠APO实验未出现勃起，该大鼠将从DM组中剔除，注射STZ后，未出现血糖升高且勃起功能正常的认为未成模(None group)。 (2)实验分组40只SPF级SD雄性大鼠，先随机分为两组(每组20只)，一组是注射STZ后观察7周，另一组是注射STZ后观察4周，再按第一步实验中得出的糖尿病勃起功能障碍大鼠成模标准及筛选标准将每一组分为对照组(未注射STZ，5只)、成糖尿病性勃起功能障碍模型组、成糖尿病性非勃起功能障碍组、未成模组。 (3)阴茎海绵体组织nNOS检测采用免疫组化SP法检测大鼠阴茎组织中nNOS的表达。按析因设计的方差分析处理数据，两两比较用LSD法。(4)观察大鼠阴茎海绵体神经组织、平滑肌细胞显微及超微结构的改变。 结果 1、糖尿病勃起功能障碍大鼠模型的建立体质量在不同时间点间及不同组别间均存在显著性差异(F=58.691，P=0.000和F=17.888，P=0.000)。存在交互效应(F=28.686，P=0.000)。四个时间点间的体质量两两间均有显著性差异(P均小于0.001)，以靠后时间点的体重均比靠前时间点的较重。注射STZ60mg/kg组与其余各组之间体质量均有显著性差异(P均小于0.001)，且以STZ60mg/kg组的体质量较轻。APO阴茎勃起实验中勃起次数在四个时间点间不存在显著性差异(F=1.427，P=0.244)。不同组别间的勃起次数不存在显著性差异(F=2.831，P=0.064)。存在交互效应(F=2.066，P=0.047)。注射STZ40mg/kg组(成DM模型4只)与注射STZ60mg/kg组(6只均成DM模型)在应用APO 100μg/kg后，阴茎勃起实验为阴性的分别有1只、3只，且均来自于DM模型中。不同时间点间的空腹血糖及不同处理组间的空腹血糖均有显著性差异(F=16.314，P=0.000和F=86.432，P=0.000)。存在交互效应(F=5.316．P=0.000)。第4 d与第1、2、3周之间血糖都有显著性差异(P均小于0.001)，且以第4 d的空腹血糖较高，余两两间无显著性差异。注射STZ60mg/kg组与其余各组之间血糖均有显著性差异(P均小于0.001)，且以STZ60mg/kg组的血糖较高。 2、nNOS的表达注射STZ后4周与注射STZ后7周这两个不同时间点间的IOD不存在显著性差异(F=0.012，P=0.913)，各处理组间IOD存在显著性差异(F=3.864，P=0.020)，不存在交互效应(F=1.016，P=0.401)，糖尿病性勃起功能障碍组IOD与对照组、糖尿病非勃起功能障碍组及未成模组均有显著性差异(P值分别为0.006、0.013和0.011)，糖尿病性勃起功能障碍组IOD均小于对照组、糖尿病非勃起功能障碍组及未成模组。 3、大鼠阴茎组织显微及超微结构的改变注射STZ后7周组DM性ED大鼠阴茎神经纤维髓鞘、轴突均有退行性变，海绵体平滑肌细胞超微结构有病理学改变。 结论 1、糖尿病成模STZ最佳注射剂量应为60mg/kg，APO诱导大鼠勃起的最佳剂量应为100μg/kg。筛选糖尿病ED模型的时间应定在注射STZ后的2周左右。 2、空腹血糖超过7.2mg/kg即可以认为是高血糖。血糖>7.2mg/kg及APO诱导未出现阴茎勃起的，可以认为是糖尿病性勃起功能障碍模型(DM&ED)。 3、糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎组织nNOS呈总体下降趋势； 4、DM性ED大鼠阴茎海绵体神经纤维发生退行性变，海绵体平滑肌细胞内成分发生变性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略语对照表

声明

第一章前言

第二章材料与方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章小结

第六章参考文献

第七章统计学处理方法的参考文献

综述 糖尿病性勃起功能障碍流行病学及病因机制研究进展

攻读硕士学位期间成果

致谢