来源于芽孢杆菌（Bacillus circulans）的β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达

摘要

中国人群中有很大一部分(约75﹪~95﹪)患有乳糖不耐受症,严重影响牛乳及乳制品的推广.利用乳糖酶生产低乳糖乳及乳制品是解决乳糖不耐受症问题的最佳途径,因此,乳糖酶在食品和乳制品工业中的作用日益显著.而生产乳糖酶就必须解决目前乳糖酶单位产量低、胞内酶生产复杂、适应范围窄等问题,以满足工业生产多方面的要求.该论文对来源于环状芽孢杆菌Bacillus circulans的乳糖酶基因lacO进行了优化改造,在不改变其原有基因所编码的氨基酸序列的基础上,根据毕赤酵母的密码子选择偏向,同时综合在真核系统中影响基因转录、翻译及mRNA稳定性等因素,设计并全序列合成了适合于在毕赤酵母中高效表达的基因lacM.改造后的乳糖酶基因与原基因相比,共改变了242个碱基,涉及182个氨基酸.将合成的基因克隆到酵母表达载体pPIC9上,与酵母α-因子信号肽编码序列以正确的阅读框架融合构成表达重组子pPIC9-lacM.同时将未改造的lacO也克隆到pPIC9上构成pPIC9-lacO.将这两个表达重组子分别转化Pichiapastoris GS115,构建出了乳糖酶工程菌株.从166株带有改造乳糖酶基因lacM的重组酵母中筛选到26株表达乳糖酶的重组子,在摇床水平上甲醇诱导144h后最高的一株的乳糖酶表达量达到2237.9U/mL发酵液.实验证明,重组毕赤酵母中乳糖酶基因lacM得到了高效表达,表达量是朱改造基因lacO的3~5倍,表达产物能有效分泌且具有正常的生物学活性.说明对基因的分子改造是成功的.乳糖酶基因lacM表达的乳糖酶分子量为66kD,比活约为1638U/mg,其酶促反应最适温度为55℃;最适反应pH值在4.6~6.4之间,适于天然牛乳的pH;且在pH3~8的范围内相对酶活力均在80﹪以上,具有较好的耐酸碱性.所试离子对酶促反应影响不大,其中Zn<'2+>、K<'+>和Fe<'2+>对酶略有激活作用,而Cu<'2+>、SDS对酶促反应有明显地抑制作用.

目录

文摘

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第一章引言

1.1乳糖酶的研究进展

1.1.1不同来源乳糖酶的酶学性质

1.1.2乳糖酶水解乳糖可能的作用机制及活性测定

1.1.3乳糖酶基因的研究进展

1.1.4乳糖酶的应用

1.2酵母表达系统

1.2.1酿酒酵母表达系统

1.2.2毕赤酵母表达系统

1.2.3影响外源基因在酵母中表达的因素

1.3本研究的目的和意义

1.3.1研究的意义

1.3.1本研究的主要目的

第二章实验材料与方法

2.1材料及仪器

2.1.1菌株与质粒

2.1.2工具酶

2.1.3试剂

2.1.4培养基与有关溶液的配制

2.1.5主要仪器

2.2实验方法

2.2.1高比活乳糖酶基因lacM设计合成及克隆

2.2.2乳糖酶基因的重组酵母的构建

2.2.3酶活性测定和标准曲线的制作

2.2.4表达的乳糖酶的酶学性质研究

第三章结果与讨论

3.1实验结果

3.1.1乳糖酶基因lacM的分子改造

3.1.2重组子pSP72-lacM的构建及酶切鉴定

3.1.3乳糖酶在毕赤酵母中的表达

3.1.4表达的乳糖酶的酶学性质

3.2讨论

3.2.1乳糖酶基因的改造

3.2.2毕赤酵母表达系统

3.2.3来源于芽孢杆菌的乳糖酶及在酵母中表达的乳糖酶酶学性质比较

结论

参考文献

致谢

作者简历