小麦族A、S、D二倍体种全长cDNA文库构建及序列初步分析

摘要

普通小麦(T.aestivum)为异源六倍体(AABBDD),基因组庞大(1.6×10<'10>bp),重复序列多(约90﹪),发掘、克隆小麦新基因意义巨大.全长cDNA文库中绝大多数克隆不仅包含完整的阅读框架,还拥有5′和3′端的非编码区,是进行功能基因组学研究的一条有效途径.在引进、消化吸收的基础上,我们对Cap-trapper法做了一些具体的改进,形成了一套简单易行的技术体系,建立了我们自己的全长cDNA文库构建技术平台.利用改进的Cap-trapper法,分别构建了乌拉尔图小麦(T.urartu)A基因组,拟斯卑尔脱(Ae.speltoides ssp speltoide)S基因组和粗山羊草(Ae.squarrosa ssp strangulata)D基因组的全长cDNA文库,库容量达到了10<'6>,重组率超过95﹪,文库中全长基因的比例分别为70﹪、89.6﹪和70﹪.基因功能注释表明,在得到的2089个基因中,有1584个基因为全长基因,1346个为小麦全长新基因,其中A基因组569个,S基因组有553个,D基因组468个.密码子使用的偏爱性是在生物长期进化历程中逐渐形成的,影响偏爱性的因素有多种,如G+C含量,基因表达水平,基因的长度,tRNA的丰度等等.我们以得到的2089个基因为考察对象,对小麦中密码子使用的偏爱性进行了分析,统计结果表明A、S、D三个基因组间密码子使用偏爱性没有差别,但单个基因组中密码子使用偏爱性明显,如AAG(Lys),GAG(Glu),GCC(Ala)使用频率超过了35‰,GCC(Ala)的使用频率甚至超过了45‰:另外,还有3种密码子的使用频率超过了30‰,12种密码子的使用频率超过20‰.通过与水稻中密码子使用的偏爱性比较,我们发现在拥有4~6个同义密码子的氨基酸中,水稻和小麦在优先使用密码子方面存在明显的不同,水稻中优先使用密码子的末尾碱基倾向于U和C,而小麦中则倾向于G和C.比较基因组学是基因组学研究的重要内容,通过进行不同层次的基因组比较,不仅可以了解不同物种的基因及基因组在结构、功能以及表达调节方面的差异,而且有助于揭示物种的起源和进化的动力.我们利用分子进化的分析方法,以测序得到的22个基因为考察对象,通过构建基因进化树来探索小麦A、S、D三个基因组的相互关系.统计结果表明,来自A、D基因组的基因间亲缘关系普遍较近,而与S基因组的关系相对较远.用EST进行的验证分析也得出了同样的结果.这一结果在之后的SNPs分析中也得到进一步验证.SNPs具有数量多,分布广,高度稳定,适于快速、自动化检测,应用前景广阔等特点,因而倍受青睐.我们以测序得到的2089个来自小麦不同基因组的基因序列为源序列,利用AutoSNPsFinder软件,从Genbank中小麦EST库中检测到1296个SNPs,开辟了一条通过单基因组测序发掘小麦SNPs的有效途径.在所得的SNPs中,有397个自A基因组,322个来自S基因组,420个来自D基因组;另外,A和D基因组共同的SNPs有154个,A和S,S和D,A和S和D基因组共有的SNPs各仅有1个.分析表明小麦中碱基平均变异率为0.914‰,与大豆中的研究结果(0.97‰)非常接近,而与玉米中的研究结果(6.3‰)相差较远.

目录

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第一章引言

1.1植物功能基因组学的发展和小麦基因组研究

1.1.1基因组学的诞生和发展

1.1.2植物功能基因组研究的技术

1.1.3小麦基因组学研究现状

1.2全长CDNA文库构建与全长CDNA

1.2.1普通cDNA文库

1.2.2差减文库

1.2.3均一化cDNA文库

1.2.4全长cDNA文库

1.3比较基因组学与小麦染色体组研究

1.3.1比较基因组学研究方法

1.3.2比较基因组学在小麦基因组研究中的应用

1.4分子进化研究进展

1.4.1系统进化树

1.4.2系统进化树的构建方法

1.4.3分子进化与系统发育分析软件

1.4.4系统进化树的构建

1.4.5分子进化的发展与应用前景

1.4.6分子进化在小麦进化研究中的应用

1.5密码子使用偏爱性研究进展

1.6普通小麦的分类和起源

1.6.1小麦的分类

1.6.2普通小麦的基因组起源

1.6.3小麦基因组起源研究方法

1.6.4小麦基因组起源研究的对象

1.7单核苷酸多态性研究进展

1.7.1 SNPs的定义及特点

1.7.2发掘、检测SNPs的技术和方法

1.7.3 SNPs的应用前景

第二章论文设计

2.1立题依据

2.1.1普通小麦的起源

2.1.2全长cDNA文库在功能基因组学研究中的地位

2.1.3小麦A、S、D基因组间的比较研究

2.1.4小麦SNPs发掘存在的困难

2.2研究目的

2.3预期目标

2.4技术路线

第三章小麦二倍体基因组供体种全长CDNA文库构建与测序

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果分析

3.2.1全长cDNA文库构建结果

3.2.2全长新基因发掘及基因功能注释

3.2.3小麦A、S、D基因组密码子使用偏爱性分析

3.3讨论

3.3.1影响cDNA文库全长比例的因素

3.3.2 cDNA全长判定

3.3.3全长cDNA文库与小麦功能基因组研究

第四章小麦A、S、D基因组亲缘关系研究

4.1方法

4.2结果与讨论

第五章小麦SNPS发掘

5.1 SNPs发掘流程

5.2结果与讨论

第六章结论

附录

附录-1

附录-2

附录-3

参考文献

致谢

作者简历

发表论文及摘要