耐热大豆β-淀粉酶的筛选及其cDNA在大肠杆菌中的表达

摘要

β-淀粉酶(EC3.2.1.2)广泛存在于各种高等植物和微生物中，它能够作用于多糖的非还原性末端，顺次切割相隔的α-1，4糖苷键，生成β-旋光的麦芽糖。耐热淀粉酶在食品及饮料工业中具有很重要的应用价值，因为提高反应温度不仅可以增加淀粉的可溶性，而且可以防止杂菌的生长，这对于降低生产成本是十分有利的。　　本实验对184份核心种质大豆的酶活力和热稳定性进行了测定。筛选得到的热稳定性最佳的6种酶均具有较宽的作用温度和作用pH，其中5种酶的半衰期(63℃、pH5.0)超过5h，表明这些大豆β-淀粉酶具有较好的酶学特性，极具工业应用价值。　　以筛选得到的大豆总RNA为模板，通过RT-PCR得到大豆济99-2492和中黄20的β-淀粉酶基因的cDNA序列(1.5kb)，测序结果表明该序列编码496个氨基酸。构建表达载体pBMY，并在大肠杆菌中将济99-2492的β-淀粉酶cDNA进行融合表达，重组酶的分子量大小为50kD，在30℃诱导，胞内酶活力可达19.61U/mL。活性染色证明：大豆的β-淀粉酶cDNA不仅能在大肠杆菌中表达出具有生物活性的蛋白质，同时还能将其分泌到胞外;酶学性质测定表明：重组酶的最适反应温度为60℃，最适pH值为6.0，与原始酶一致；在63℃保温5小时仍然具有45％以上的初始酶活力，说明该重组酶具有很好的耐热性。

目录

文摘

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第一章引言

1.1 β-淀粉酶的作用方式和结构特点

1.1.1β-淀粉酶的作用机理

1.1.2β-淀粉酶的结构特点

1.2β-淀粉酶的酶学性质

1.2.1植物来源的β-淀粉酶

1.2.2微生物来源的β-淀粉酶

1.3β-淀粉酶的纯化方法

1.3.1植物β-淀粉酶的提取和纯化方法

1.3.2微生物细胞的破碎和微生物β-淀粉酶的纯化方法

1.4β-淀粉酶的基因工程

1.4.1植物β-淀粉酶的基因工程研究

1.4.2微生物β-淀粉酶的筛选和基因工程研究

1.5研究目的和意义

第二章耐热大豆β-淀粉酶的筛选及其酶学性质研究

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1麦芽糖标准曲线的制定与酶活力计算方法

2.2.2核心种质大豆β-淀粉酶的酶活力

2.2.3核心种质大豆β-淀粉酶的热稳定性

2.2.4大豆β-淀粉酶最适作用pH

2.2.5大豆β-淀粉酶最适反应温度

2.2.6 pH对大豆β-淀粉酶稳定性的影响

2.2.7六个大豆品种所含β-淀粉酶的分子量测定

2.2.8六个大豆品种所含β-淀粉酶的部分酶学特性

2.2.9生长纬度与酶活力关系分析

2.3讨论

第三章耐热大豆β-淀粉酶cDNA的克隆及序列分析

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1引物的设计方案

3.2.2RNA的提取

3.2.3 RT-PCR克隆

3.2.4大豆β-淀粉酶基因的测序与分析

3.2.5与已知β-淀粉酶基因编码序列的比较、分析

3.3讨论

第四章大豆β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1表达载体的构建

4.2.2重组β-淀粉酶的活性检测

4.2.3pBMY在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

4.2.4重组酶活力及温度对产酶活力的影响

4.2.5重组酶的酶学性质

4.3讨论

结论

参考文献

致谢

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