淀粉酶产生菌的筛选及α-淀粉酶在米曲霉中的同源表达

摘要

本研究为了获得α-淀粉酶高产菌株，做了两方面的工作。第一是从土壤中筛选高产淀粉酶菌株，并对其进行分子鉴定。第二是构建多拷贝α-淀粉酶表达盒的米曲霉工程菌株，以提高α-淀粉酶的产量，主要研究内容及结果如下： (1)从采自福州面粉加工厂附近的土壤中筛选到了14株淀粉酶产生菌。根据菌落形态判断，这14株菌均为霉菌。在淀粉-琼脂鉴定板上通过测定淀粉水解圈的大小，定性分析各株菌产淀粉酶的能力，发现菌株FS160产淀粉酶能力最强，克隆FS160的18S rDNA基因，测序并将序列提交GenBank(登陆号：FJ840490)。根据18SrDNA序列进行系统进化分析，发现其与烟曲霉(A.fumigatus)亲缘关系最近。 (2)以米曲霉FS1125(Aspergillus oryzae FS1125)基因组DNA为模板，克隆了米曲霉α-淀粉酶表达盒序列和ITS序列，将测序结果提交GenBank(登陆号分别为：FJ859877和FJ859878)。将α-淀粉酶表达盒序列连接到ITS序列中间，再将融合序列ITS-amy连接到pRO-hygro载体上，构建了重组载体pBC-hygro-IA，然后用PEG-原生质体法将载体pBC-hygro-IA转化米曲霉FS1125原生质体，在含有潮霉素B的双层PDA培养基上筛选转化子，对挑选出的转化子进行基因组PCR验证，确定一株转化子成功整合了ITS-amy到基因组中。将这株转化子在含有潮霉素B的PDA选择性培养基上连续传代4次，获得了同核的米曲霉转化子，将其命名为：Aspergillus oryzae FS1125-T1。通过SDS-PAGE和Native-PAGE分析发现，米曲霉α-淀粉酶的分子量约为52kDa，并且米曲霉FS1125-T1比原始菌株FS1125液体发酵状态下α-淀粉酶表达量有明显提高。 根据中温α-淀粉酶活性测定方法检测了米曲霉FS1125发酵液中的α-淀粉酶活性，米曲霉FS1125发酵液中α-淀粉酶活性最高出现在发酵96h时，酶活为4.5U/mL。同时研究了温度和pH值对α-淀粉酶活性的影响，α-淀粉酶的最适反应温度是50℃，最适反应pH值为5.0。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1微生物淀粉酶简介

1.1.1米曲霉中性α-淀粉酶简介

1.1.2黑曲霉耐酸性α-淀粉酶简介

1.2米曲霉简介

1.3米曲霉表达系统研究进展

1.3.1同源蛋白在米曲霉中的表达

1.3.2异源蛋白在米曲霉中的表达

1.4本课题研究的目的和意义

第2章淀粉酶产生菌的筛选及其系统进化分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与讨论

2.3.1琼脂块法筛选淀粉酶产生菌

2.3.2发酵液中淀粉酶活性测定

2.3.3菌株FS160的18S rDNA基因序列的扩增

2.3.4 18S rDNA基因与pMD18-T载体的连接及转化

2.3.5 FS160的18S rDNA序列测定及分析

2.4小结

第3章多拷贝α-淀粉酶表达盒米曲霉工程菌的构建

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果与讨论

3.3.1米曲霉FS1125 ITS序列和α-淀粉酶表达盒序列的克隆及序列分析

3.3.2重组载体pBC-hygro-IA的构建

3.3.3基因组PCR法验证米曲霉阳性转化子及同核转化子的获得

3.3.4 SDS-PAGE检测米曲霉FS1125和米曲霉转化子FS1125-T1 α-淀粉酶的表达

3.3.5 Native-PAGE和活性染色分析米曲霉FS1125和米曲霉转化子FS1125-T1 α-淀粉酶活性

3.4小结

第4章米曲霉FS1125所产α-淀粉酶的活性测定及其酶学性质的初步分析

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2方法

4.3结果与讨论

4.3.1米曲霉.FS1125发酵过程中淀粉酶活性及pH值变化

4.3.2 pH值和反应温度对米曲霉FS1125 α-淀粉酶活性的影响

4.4小结

结论

展望

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历