节瘤拟杆菌早期鉴别诊断—PCR检测方法的建立与应用

摘要

本研究根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物，利用聚合酶链式反应(PCR)建立了一种简单区分该菌菌群的检测方法，结果表明，PCR检测方法适宜腐蹄病的早期诊断；用病样对应血清与纤毛抗原琼扩实验，健康动物存在该菌的抗体，表明通过检测血清抗体间接确定抗原的血清学方法受抗体产生消退延迟影响不能区分曾经感染和当前感染的菌型。此外发现制约PCR直接检测临床病样的限制因素是病样中细菌外的抑制物，采样部位及病样处理直接影响PCR对目标菌的检出率。为进一步验证扩增条带为目标菌序列片段，采用PCR特异扩增条带测序验证，节瘤拟杆菌扩增产物和病样扩增阳性产物测序显示，扩增产物序列一致。

目录

文摘

英文文摘

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第一章引言

1.1研究的意义及目的

1.2节瘤拟杆菌检测方法研究进展

1.2.1分离鉴定

1.2.2血清学方法

1.2.3分子生物学检测

1.3本研究的内容和方法

第二章实验材料和方法

2.1材料

2.1.1菌株及环境菌群

2.1.2血样

2.1.3试剂与主要仪器：

2.2方法

2.2.1引物设计

2.2.2样品采集及处理

2.2.3 PCR检测体系建立

2.2.4引物特异性试验

2.2.5临床病样检测

第三章试验结果

3.1模板制备方法

3.2 PCR反应体系建立

3.2.1适宜退火温度选定

3.2.2适宜的PCR反应体系及循环参数

3.2.3灵敏度

3.3引物特异性

3.4临床病样检测

3.4.1第一次采样的综合检测结果

3.4.2临床病样涂片显微镜下观察结果

3.4.3第二次临床病样及环境样品的PCR检测结果

3.4.4病样PCR反应的可重复性

3.4.5临床病样直接PCR产物测序验证结果

3.5 PCR产物电泳图

第四章讨论与结论

4.1讨论

4.1.1 PCR试验应分区

4.1.2模板制备方法

4.1.3PCR灵敏度影响因素

4.1.4引物特异性实验

4.1.5 PCR影响因素

4.1.6临床病样检测

4.1.7血样的PCR及琼脂扩散试验

4.1.8 PCR检测方法与血清学方法对比

4.2结论

参考文献

附 录

致谢

作者简历