我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究

摘要

本研究用PCR方法对马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株(Agen-EIAV)感染马外周血白细胞的前病毒DNA进行了分段扩增，克隆和序列测定，并参考Genbank已经发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列，应用基因分析软件拼接出Agen-EIAV全基因核苷酸序列。经分析Agen-EIAV株前病毒基因组全长为8227bp，与我国马传贫辽宁强毒株(LN)、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株(DLV)及美国代表毒株(AF028232)核苷酸序列比较，同源率分别为65％、65％和75％。与AF028232株gag、pol和env、gp90和gp45基因核苷酸同源率分别为99％、99％、75.6％、69.4％和80.4％；而与我国DLV的同源率分别为79.7％，82.3％，72.8％，65.2％和78.6％。Agen-EIAV株gag和gp90推导氨基酸序列与美国4个毒株的氨基酸序列高度同源，而与我国4个毒株却存在很大的差异。 本研究对接种Agen-EIAV的试验马(16＃)出现的四个发热期(23d、40d、51d和70d)的外周血单核细胞前病毒DNAgag和gp90的核苷酸序列进行了监测，结果发现四个发热期中前病毒gag核苷酸序列变化不明显，变异率在1％之内。gp90核苷酸序列变化较大，变异率在8～10％之间，可划分出A1、A2、A3和A4四个高变区。其中A1、A3和A4在马体发病的整个过程中均发生一次变异，而A2区在第三个发热期发生变异后，在第四个发热期又回复了突变。结果表明，gag在马传染性贫血病毒与宿主细胞基因组整合之后非常稳定，可以选择此区域设计鉴别诊断的引物。从gp90推导的氨基酸序列可划分为5个可变区，都与N-连接的糖基化位点有关系，进一步证明马传贫病毒囊膜糖基化位点的变化与毒力相关。 本研究在对马传染性贫血病毒美洲等流行毒株和我国弱毒疫苗株全基因序列比较分析的基础上，共设计了11条引物，用于在病毒接种驴白细胞培养物上进行PCR鉴别诊断引物的筛选，通过试验筛选确定选用在gag区设计的6条引物。通过对2匹健康马(2＃和31＃)，9匹分别接种我国DLV(1＃、9＃和10＃)、Agen-EIAV(16＃、45＃和46＃)和美国代表毒株(Wyoming-EIAV)(3＃、4＃和44＃)试验马的检测及PCR反应条件的进一步优化，而确定鉴别马传贫病毒美洲流行毒株和我国弱毒疫苗株的套式多重PCR方法。试验结果表明当用引物C1/C2n/C3n进行第二轮PCR扩增时，从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出与设计相符的两个片段，分别为675bp和400bp，而美洲流行毒株接种马外周血白细胞只能扩增一条675bp的片段；当用引物C1/AF2n/C3n进行扩增时，从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出一条675bp的片段，而美洲流行毒株接种马外周血白细胞却能扩增出两个片段，分别为675bp和400bp。而健康马外周血白细胞扩增不任何条带。本试验同时对3匹疫苗免疫马、2匹美洲流行毒株慢性传贫马(45＃和46＃)和4匹急性传贫马(16＃、3＃、4＃和44＃)进行了长时间的跟踪检测，分别可在接毒后最早第7-30天从外周血中检出病毒，至接种后12个月大都可以检出。结果表明本试验建立的PCR鉴别诊断方法具有很好的稳定性和可重复性。本试验还用real-timePCR的方法检验本试验建立的PCR鉴别诊断方法的敏感性，结果表明套式多重PCR可以检出我国DLV免疫马最低病Ⅰ毒核酸模板量为2.11×102拷贝/mL，Agen-EIAV为1.35×102拷贝/mL，Wyoming-EIAV为2.37×102拷贝/mL。 本试验对已构建并转染成功的驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株感染性克隆加以改造，构建了两株S2基因突变的感染性克隆(标记疫苗株)。一株是在S2基因内部引入两个终止密码子，致使S2基因缺失，命名为pLG-np2(S2基因缺失)；另一株在S2基因内部插入了一个鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势性B细胞表位5B19，构建了驴胎皮肤细胞弱毒标记疫苗株命名为pLG-5B19(标记疫苗株)。在驴胎皮肤细胞(FDD)上转染，并经连续盲传，至第四代时检测pLG-5B19和pLG-np2转染细胞培养上清的RT酶活性均为强阳性，且细胞病变明显，在电镜下可见明显的病毒颗粒，分别命名为vpLG-5B19和vpLG-np2。体外RT酶活性检测及病毒载量变化的监测表明vpLG-5B19在细胞水平上复制特性与亲本感染性克隆pLGFD3-8非常相似。而vpLG-np2复制水平相对延迟，但是最后仍能达到亲本毒株的复制水平。

目录

文摘

英文文摘

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第一章绪论

第二章马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒全基因序列测定与分析

第三章马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒gag和gp90在马体内的变异分析

第四章我国马传染性贫血病弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立

第五章马传染性贫血病标记疫苗的研究

第六章结论

参考文献

附录

致谢

作者简历