小麦（Triticum aestivum L.）高分子量麦谷蛋白1By15和1Dx1.5基因高效表达载体的构建及转化研究

摘要

本文在已克隆该亚基编码基因的基础上，从基因调控入手，研究Glu-1By15基因在种子发育过程中的表达变化规律，克隆和筛选胚乳特异表达的强启动子，构建载体，并进行小麦转化，为用分子手段进行小麦品质改良提供技术和科学依据。 对1Bx14+1By15携带者小偃54、小偃6号、陕优225和偃展1号籽粒HMW-GS蛋白和RNA进行提取和定量，发现无论翻译水平还是转录水平Glu-1Bx14的表达要明显高于Glu-1By15，并且在品种间存在一定的差异。对陕优225和小偃54两个品种中1By15基因组织和发育时间的表达特异性研究发现，Glu-1By15仅在胚乳发育特定时期表达，并且表达阶段和表达峰值在品种间存在差异。 根据已知的序列特征，用PCR法克隆了1By15的部分启动子序列，并克隆了1Bx14，1By8，1Dx2和1Dy12等基因的启动子。序列分析表明HMW-GS基因的启动子序列同源性较高，都具有典型的HMW-GS基因启动子的序列特征，发现1Bx14的启动子序列具有明显的特异性。在启动子的瞬时转化实验中，它们操纵GUS基因表达的水平与其所操纵的结构基因(HMW-GS基因)表达水平结果相一致，即1By15的启动子活性低于1Bx14子的启动。此外我们还得到了能启动GUS强表达的Glu-1Dx2基因的启动子P2。 从烟草和水稻中成功克隆了两个已知的基质序列(MARs)。瞬时表达实验表明，仅在基因表达盒前侧加入MARs不能发挥其促进基因转录表达的作用，反而可能会对基因表达起到抑制作用。 利用内源强启动子P2(Glu-1Dx2基因的启动子)和MARs序列构建了1By15和1Dx1.5t基因的高效表达载体，用基因枪法和花粉管通道法进行了小麦转化研究。在对1By15的基因枪法转化中，共转化质粒pUC-MT2-15和pACH20的转化效率明显高于pCAB2-15。Southern杂交证明有4个转基因品系(T0)有1By15基因的插入；SDS-PAGE检测到6个T1株系中目的蛋白成功表达。 通过花粉管通道法进行1By15的转化，只有pCAB2-15载体得到了56个PCR检测为阳性的独立株系。Southern杂交证明有2个转基因品系(T1)有1By15基因的插入；经SDS-PAGE检测有6粒(T2)种子得到了目的蛋白的表达。发现该基因的导入可能干扰了受体品种原有种子蛋白基因的表达，但Western杂交分析证明，转化籽粒低分子量区出现的一些未知蛋白(可能)并不是高分子量谷蛋白的变异体。 对于1Dx1.5t基因的转化，PCR初步鉴定表明基因枪法转化率平均为1.9％。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：Abbreviations(英文缩略表)

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章文献综述：小麦转基因概况及与品质相关的高分子量麦谷蛋白的遗传转化研究

第二章HMW-GS 1By15基因的表达分析

第三章HMW-GS基因启动子和MARs序列的克隆及GUS瞬时表达分析

第四章 小麦HMW-GS 1By15和1Dx1.5t高效表达载体的构建与转化

4.1小麦HMW-GS 1 By15两个表达载体的构建与普通小麦的转化

4.2小麦HMW-GS 1Dx1.5t高效表达载体的构建与小麦转化

4.3讨论

第五章结论

参考文献

主要试剂的配制

致谢

作者简历