紫茎泽兰EaCBF1基因的克隆及其在不同地理种群的遗传差异分析

摘要

紫茎泽兰是我国为害最严重的恶性外来入侵杂草之一,原产于墨西哥至哥斯达黎加一带,后作为观赏植物引入欧洲,目前已广泛分布于世界30多个国家和地区.该草于20世纪40年代经缅甸传入我国,短短几十年间已经遍布我国西南地区6个省市,并以每年几十公里的速度向我国北方地区扩散. 植物在长期进化中普遍形成了可诱导激活的抗逆境潜能.植物响应低温逆境形成了复杂的网络关系,并受多种调控基因和功能基因的控制,这种信号互作关系在先前的研究中已经得到证实.紫茎泽兰作为一种热带亚热带植物有逐步向温带蔓延的趋势,必然有其特殊的抗寒机制,这很可能与调控因子的控制有关.在拟南芥、番茄、棉花等多种植物中发现的CBF转录因子是植物应答低温逆境的关键调控因子之一,一直倍受重视.在综述了紫茎泽兰入侵机制及国内外关于低温应答转录因子CBF研究进展的基础上,本文从紫茎泽兰低温调控因子CBF的克隆入手,进行了了紫茎泽兰CBF序列分析比对、诱导表达分析、种群间遗传差异及遗传转化等一系列研究,为从分子层面上解释紫茎泽兰低温适应性机制奠定了基础.主要结果如下: 1.通过分析拟南芥、番茄等植物的CBF氨基酸核心区设计简并引物,以DNA为模板,获得了4个同源性在70﹪以上的核心区片段.根据已知片段设计特异引物,运用RACE技术从低温诱导下的紫茎泽兰cDNA中获得一个全长800bp的CBF基因,定名为EaCBF1.生物信息学分析发现,该基因编码一个由219个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为22.4kD.该蛋白具有7个非连续氨基酸构成的核定位信号,60个氨基酸组成的保守AP2结合域,以及一个3'的酸性转录激活域.不同植物CBF1基因比对显示,EaCBF1与苹果CBF1基因亲缘关系最近其次是番茄,和葡萄的CBF1最远. 2.由于CBt 基因家族成员间同源性高且多半为单拷贝基因,我们以EaCBF1为探针通过Southem杂交确定了紫茎泽兰基因组内至少有4个CBF家族成员,与核心区克隆测序结果一致. 3.运用半定量RT-PCR技术分析了 EaCBF1 在不同逆境胁迫下的表达水平.结果显示,EaCBF1在低温下表达量最高,其次是干旱和外源ABA,而高盐胁迫也会诱导该基因的微弱表达.表明各种逆境信号间有串话现象.为了进一步研究EaCBF1的功能,我们构建了一个含有CaMV35S启动子的组成型植物表达载体,并通过农杆菌介导法将该基因转化到烟草中,已获得了转基因植株,生理生化检测正在进行中. 4.应用等位基因SNP技术检测了15个地理种群EaCBF1编码区的单核苷酸多态性.通过测序比对发现,目前我国西南几个受紫茎泽兰危害较大的省市所采集的植物样本的EaCBF1在核苷酸水平上有11个碱基的差异,而由于密码子的简并性,其氨基酸水平上有3处差异.这些结果表明该基因的核苷酸序列已经形成一定程度的遗传分化,主要表现在云南、四川及贵州种群相对于重庆和广西百色种群具有更高的多态性.从整体趋势看云南种群与四川和贵州种群亲缘关系近,与重庆和广西种群相对较远. 本研究以CBF 低温响应转录因子为对象从温度这个限制物种分布的关键环境因子入手,分析并推测了紫茎泽兰在逆境适应性方面的分子机制.这些研究对阐明紫茎泽兰的入侵扩张机理,预测适生范围具有重要的理论价值和现实意义.

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表、图表目录

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章前言

1.1外来生物入侵机制研究进展

1.1.1外来生物入侵机制的探询：从宏观到微观

1.1.2入侵生物抗逆适应机制的研究现状

1.1.3紫茎泽兰入侵机制

1.2转录因子CBF在植物抗寒适应性研究中的重要意义

1.2.1植物低温胁迫应答基因

1.2.2 CRT作用元件的发现以及CBF编码基因的克隆

1.2.3 ICE-CBF调控途径及其在植物低温驯化中的作用

1.2.4多种环境胁迫信号转导的串话现象

1.3本研究的目的与意义

1.4技术路线

第二章低温应答转录因子的克隆

2.1供试材料

2.1.1植物材料

2.1.2主要试剂和耗材

2.1.3菌株与质粒

2.1.4主要仪器设备

2.2方法

2.2.1 CTAB法提取紫茎泽兰基因组DNA(小量)

2.2.2设计简并引物PCR获得CBFs核心区

2.2.3 PCR产物的纯化

2.2.4 连接

2.2.5转化测序

2.2.6 RACE原理

2.2.7总RNA提取

2.2.8 3’端RACE

2.2.9 5’端RACE

2.2.10基因全长的拼接和测通

2.3结果与分析

2.3.1DNA和RNA提取

2.3.2紫茎泽兰CBFs基因核心区序列分析

2.3.3片段CBFd的全长克隆

2.4讨论

第三章紫茎泽兰家族成员数检测

3.1材料

3.1.1实验材料

3.1.2主要试剂和耗材

3.1.3主要仪器设备

3.2方法

3.2.1 CTAB法提紫茎泽兰基因组DNA(大量)

3.2.2酶切、电泳：

3.2.3 DNA的印迹转移

3.2.4预杂交

3.2.5探针DNA的放射性标记

3.2.6杂交

3.2.7洗膜

3.2.8显影原理：

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章紫茎泽兰EACBF1表达及功能分析

4.1材料

4.1.1供试材料

4.1.2供试菌株和植物

4.1.3仪器设备

4.2方法

4.2.1内参基因actin的克隆

4.2.2模板定量

4.2.3 p2301-T-4A重组载体的构建

4.2.4 p2301-T-4A-CBF植物表达载体的构建

4.2.5电击转化农杆菌LBA4404

4.2.6盘法转化野生型烟草

4.2.7转基因烟草的鉴定

4.2.8转空载体烟草的检测

4.3结果与分析

4.3.1不同环境胁迫对EaCBF1表达量的影响

4.3.2表达载体的构建

4.3.3植物表达载体的鉴定

4.3.4重组载体的遗传转化

4.3.5转基因植株的筛选及生理检测

4.4讨论

第五章不同地理种群单核苷酸多态性分析

5.1材料与方法

5.1.1样品采集信息

5.1.2等位基因单核苷酸多态性的获得

5.2结果与分析

5.3讨论

附表

第六章结论与展望

6.1结论

6.2本研究的创新点

6.3展望

参考文献

附录

致谢

个人简介