光合细菌PCR检测技术的建立及其应用研究

摘要

本论文以光合细菌中的沼泽红假单胞菌和类球红细菌为研究对象,根据其16S rDNA序列和gyr序列设计和筛选出适用于这两种菌(种水平)鉴定的PCR特异引物,优化了PCR反应体系和程序,建立的分子生物学方法解决了微生物肥料光合细菌产品检测过程中出现的操作繁琐、检测周期长等问题.进一步应用荧光定量PCR技术进行光合细菌含量测定研究,初步建立了定量检测的方法,对该技术在光合细菌菌数测定中应用做了探索性的研究. 通过分析光合细菌相关基因序列的可变区,设计了3对沼泽红假单胞菌和2对类球红细菌特异引物,根据其对各自模式菌株的PCR扩增结果,筛选出了这两种菌的PCR特异引物.通过对PCR反应体系中镁离子浓度、退火温度进行优化,建立了沼泽红假单胞菌和类球红细菌PCR鉴定方法.使用PCR方法对7个属18个种共24株微生物肥料中常见光合细菌、与光合细菌常复合使用的菌种和杂菌进行检测,结果目的菌株均有清晰目的条带出现,非目的菌株均无扩增产物.对PCR扩增产物进行克隆测序验证其同源性,其序列与靶基因序列的同源性达100﹪.使用PCR方法检测了来自不同企业的6个光合细菌菌剂产品,结果显示PCR方法检测符合率为100﹪,高于传统的检测方法.上述实验结果表明,所建立的光合细菌的沼泽红假单胞菌和类球红细菌特异PCR检测方法准确、可靠、灵敏性强,与传统方法相比检测步骤简单,缩短了检测时间. 通过比对紫色非硫菌科的光合细菌、微生物肥料常用菌种的16S rDNA序列,设计了紫色非硫菌科光合细菌的通用引物,PCR实验结果表明该对引物在微生物肥料常用的菌种范围内,对光合细菌具有较高的特异性.使用所设计的通用引物,采用荧光定量SYBR Green I技术,建立了荧光定量PCR检测光合细菌的方法.使用该方法对系列稀释的己知菌数样品的DNA模板进行荧光定量PCR扩增,建立了荧光定量检测标准曲线,标准曲线回归方程为:Y=-4.12x+51.52,相关系数为0.9983,检测范围在4.9x10<'4>CFU/mL～4.9x10<'47>CFU/mL.使用荧光定量PCR方法对10个光合细菌样品的菌数进行了测定,所测菌数高于传统测定方法最大或然数法(MPN法)所测数量,但两者的相关性为0.98,(P<0.01),表明荧光定量PCR方法能够反映出不同光合细菌产品数量的差异.通过测定建立校正参数后,该方法将可用于光合细菌产品菌含量的快速准确测定.

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章绪论

1.1光合细菌

1.1.1光合细菌简介

1.1.2光合细菌的多样性功能及其应用

1.1.3光合细菌的鉴定和菌含量测定

1.2 PCR技术及其在微生物鉴定与检测中的应用

1.3定量PCR技术

1.3.1有限稀释法

1.3.2竞争PCR

1.3.3实时荧光PCR

1.4 实时荧光定量 PCR研究进展

1.4.1定量原理

1.4.2荧光标记的种类

1.4.3实时荧光定量PCR特点

1.4.4实时荧光定量PCR的应用

1.5本论文研究目的和意义及研究内容

1.6技术路线

第二章实验材料和基本实验方法

2.1实验材料

2.1.1菌株

2.1.2主要实验仪器：

2.1.3培养基

2.1.4试剂

2.2基本实验方法：

2.2.1光合细菌的培养

2.2.2光合细菌总DNA提取

2.2.3光合细菌基因组DNA的电泳检测

2.2.4光合细菌基因组DNA的浓度和纯度测定

第三章光合细菌PCR鉴定技术的建立及其应用研究

3.1实验方法

3.1.1引物设计与初筛

3.1.2 PCR反应条件的建立

3.1.3 PCR鉴定方法特异性验证

3.1.4 PCR产物序列测定

3.1.5 PCR灵敏度检测：

3.1.6 PCR方法在光合细菌产品检测中的应用

3.2结果与分析

3.2.1引物设计与筛选

3.2.2沼泽红假单胞菌特异PCR方法的建立与验证

3.2.3类球红细菌特异PCR方法的建立与验证

3.2.4两种特异引物对样品的检测结果

3.3讨论

3.3.1引物的设计及其特异性

3.3.2特异PCR反应条件的确定

3.4小结

第四章实时荧光定量PCR在光合细菌检测中的研究与应用

4.1实验方法

4.1.1光合细菌通用引物设计

4.1.2光合细菌通用引物普通PCR通用性和特异性验证

4.1.3荧光定量PCR方法的确立及其有效性和特异性验证

4.1.4 DNA提取方法

4.1.5荧光定量PCR标准曲线的制作

4.1.6荧光定量PCR方法与MPN法的测定结果比较

4.2结果与分析

4.2.1通用引物的设计

4.2.2通用引物特异性验证

4.2.3实时荧光PCR方法的有效性和特异性验证结果

4.2.4实时荧光定量PCR标准曲线的建立

4.2.5实时荧光定量PCR方法与MPN法的测定结果比较

4.3讨论

4.3.1实时荧光定量方法的选择

4.3.2标准曲线的制作

4.3.3荧光定量PCR与MPN方法的比较

4.4本章小结

第五章全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历