胸膜肺炎放线杆菌ApxⅢA基因的克隆表达及毒力因子免疫原性的测定

摘要

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagiouspieuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pieuropneumoniae,APP)引起的以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病.自1957年Pattison首次报道本病以来,该病在世界范围内广泛流行,并给各国养猪业带来了严重的经济损失.由于APP极易产生耐药性,疫苗接种是防控本病的主要措施.目前,国内主要使用灭活疫苗预防和控制本病.但由于APP血清型较多,灭活疫苗的保护效果十分有限.因此,开发新型疫苗已经成为研究热点. 本研究通过基因工程方法,重组表达APP的一种毒力因子,制备了重组亚单位疫苗,并进行了免疫保护效果的探讨.研究表明,APP分泌的外毒素(ApxI、ApxIII)和外膜蛋白(Omp)等不仅是APP重要的毒力因子,同时也是重要的免疫原性因子. 1 成功构建了重组表达载体pET-ApxⅢA.并将3种重组表达载体pET-ApxⅢA、pET-ApxIA、pPRo-Omp(后二种为实验室已经构建好)分别在大肠杆菌JM109(DE3)中进行诱导表达,获得3种重组蛋白p:ET-ApxIA(rApxI)、pET-ApxⅢA(rApxⅢ)、pPRo-Omp(rOmp),大小分别约41、41和45Ku Western-blotting分析表明,3种重组蛋白具有良好的抗原性. 2 将rApxⅠ、rApxⅢ和rOmp组合作为疫苗I组,rApxⅠ、rApxⅢ、rOmp和灭活菌苗组合作为疫苗Ⅱ组,APP 1、3、7型菌制备的灭活疫苗作为疫苗Ⅲ组,PBSⅣ作为空白对照组,进行家兔的免疫试验.免疫共分3次,每次间隔两周.通过间接血凝试剂盒检测血清特异性抗体、评价重组亚单位疫苗的免疫保护效果.结果表明,疫苗II组的抗体水平均显著高于疫苗Ⅲ组,但是疫苗Ⅰ组抗体水平不如疫苗Ⅲ组,其血清效价最高滴度为1:256.

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章引言

1.1猪传染性胸膜肺炎的概况

1.2病原学

1.3流行病学

1.4临床症状和病理变化

1.4.1临床症状

1.4.2病理变化

1.5诊断方法

1.5.1临床诊断

1.5.2微生物学诊断

1.5.3血清学诊断

1.5.4分子生物学诊断

1.6胸膜肺炎放线杆菌的主要毒力因子研究进展

1.6.1 ApxⅠ

1.6.2 ApxⅡ

1.6.3 ApxⅢ

1.6.4 ApxⅣ

1.6.5荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)

1.6.6脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)

1.6.7外膜蛋白(Outer membrane protein ,Omp)

1.6.8其它毒力因子

1.7猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展

1.7.1灭活疫苗

1.7.2弱毒活疫苗

1.7.3 Ghosts疫苗

1.7.4亚单位疫苗

1.8研究的目的及意义

第二章胸膜肺炎放线杆菌APXⅢA基因的克隆和原核表达

2.1材料与方法

2.1.1菌株与质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4细菌的培养

2.1.5 APP基因组DNA的提取

2.1.6目的DNA片断克隆到pMD18-T载体

2.1.7克隆重组质粒的鉴定

2.1.8表达载体的构建

2.1.9重组菌的诱导表达

2.2结果与分析

2.2.1 ApxⅢA基因的PCR扩增产物

2.2.2重组质粒的鉴定

2.2.3重组表达质粒的鉴定

2.2.4 ApxⅢA基因的表达及SDS-PAGE

2.3讨论

第三章毒素、外膜脂蛋白的表达及重组蛋白的纯化

3.1材料与方法

3.1.1菌株及质粒

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器与设备

3.1.4重组质粒的表达及鉴定

3.1.5重组蛋白的提纯与复性

3.2结果与分析

3.2.1重组蛋白的鉴定

3.3讨论

第四章动物免疫试验

4.1材料与方法

4.1.1重组表达蛋白和实验动物

4.1.2主要试剂

4.1.3疫苗的制备

4.1.4动物分组及免疫

4.1.5抗体监测

4.2结果与分析

4.3讨论

第五章全文总结

参考文献

致谢

作者简历

附录