非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

摘要

非洲猪瘟(ASF)由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起，死亡率高达100％。由于该病毒特殊的免疫逃避机制，目前尚无有效治疗手段。虽然我国并无ASF疫情，但随着各种国际交往的增多，受到该病威胁的可能性也越来越大，建立一种高效灵敏，简便快捷的非洲猪瘟检测技术具有很重要的现实意义。环介导等温扩增法(LAMP)因其独特的设计被广泛应用于各种病原检测，目前国内外还没有关于非洲猪瘟LAMP检测方法的报道。因此本研究建立的ASFV-LAMP方法不但具有实际应用价值，也具有较高的科研意义。 非洲猪瘟P72基因高度保守，是建立核酸快速检测方法的理想位点。本研究利用生物信息学手段选定了P72基因C端保守序列的一部分作为靶序列，通过PrimerExplorer3.0软件分析，依据GC含量，末端稳定性，二级结构等参数，设计筛选出了4套LAMP引物。由于LAMP的扩增产物片段大都在100到300bp，一旦出现非特异性扩增，则很难分辨。因此本研究为每个扩增产物设计了酶切位点用于后续的鉴定，以保证实验的可靠性。以LAMP保守参数进行的扩增结果表明，四套引物中4FIP，4BIP，4F3，4B3引物组扩增效率最佳，产物条带清晰明显，且酶切片段大小与预期相符。 使用该引物组建立ASFV-LAMP方法，对LAMP实验中的几个重要参数进行了优化。包括温度、镁离子浓度、内外引物和甜菜碱浓度等。实验结果表明，镁离子和内引物浓度对扩增效率影响最为明显，在镁离子浓度为8mM，内引物浓度为1.6～2.4μM时效果最好；扩增效率虽与内引物浓度呈正相关，但当内引物浓度超过3.0μM以后，反而对反应产生抑制作用。温度、外引物、甜菜碱等虽然也能提高扩增效率，但梯度试验结果显示，当数值达到一定程度后，影响便不明显，因此在出现清晰阳性条带的实验组中取中间值作为ASFV-LAMP方法的参数，即温度63℃，外引物终浓度0.2μM，甜菜碱浓度1.0M。 在上述优化结果基础上，初步建立ASFV-LAMP方法。以OIE标准ASFV-PCR检测方法为参照，进一步进行时间、灵敏度、特异性及可靠性实验。时间梯度实验显示，该方法只需要30分钟即可完成，大大少于参照PCR方法；对梯度稀释模板的检测表明，ASFV-LAMP能够检测到5拷贝的模板，且在低拷贝模板检测中加入Loop引物，能使扩增效率提高至与高拷贝模板相同的水平，而参照的PCR法只能检测到500个拷贝的模板，ASFV-LAMP的灵敏度是参照PCR的100倍；以猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒等常见猪DNA病毒基因组为模板进行特异性试验，没有出现非特异性扩增；在重复性和稳定性试验中，分别对8个不同批次模板以及对同一模板进行8次实验，扩增产物稳定，证明该方法具有良好的可靠性。 综上所述，本研究初步建立了一种快速灵敏，高效可靠的非洲猪瘟LAMP检测方法，为后续开发具有实用价值的ASFV-LAMP快速检测试剂盒打下了坚实的基础。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略表

声明

第一章引言

1.1非洲猪瘟病毒分子生物学研究进展

1.1.1概述

1.1.2病毒结构

1.1.3基因特征

1.1.4主要蛋白

1.1.5侵入机理

1.1.6免疫逃避机制

1.1.7小结

1.2非洲猪瘟病毒检测技术的研究进展

1.2.1免疫学检测技术

1.2.2核酸检测技术

1.2.3小结

1.3环介导等温扩增技术

1.3.1技术特点

1.3.2反应原理

1.3.3引物设计

1.3.4具体操作

1.3.5应用实例

1.3.6小结

1.4本研究的意义

第二章 目的基因序列分析及LAMP引物设计

摘要

2.1非洲猪瘟病毒P72蛋白基因序列分析

2.2引物设计

2.2.1软件使用

2.2.2参数调整

2.2.3引物筛选

2.3酶切位点分析

2.4总结与讨论

2.4.1总结

2.4.2讨论

第三章 引物验证及LAMP重要参数的优化

摘要

3.1材料与方法

3.1.1质粒与菌株

3.1.2引物

3.1.3试剂与试剂盒

3.1.3主要仪器设备

3.1.4质粒模板的准备

3.1.5引物的验证

3.1.6反应温度的优化

3.1.7镁离子浓度的优化

3.1.8引物浓度的优化

3.1.9甜菜碱的作用

3.2结果

3.2.1引物验证结果

3.2.2温度优化结果

3.2.3镁离子浓度优化结果

3.2.5甜菜碱的效果

3.3结论与讨论

3.3.1结论

3.3.2讨论

第四章 ASFV-LAMP检测方法的验证

摘要

4.1材料与方法

4.1.1质粒与病毒基因组

4.1.2试剂及试剂盒

4.1.3主要仪器设备

4.1.4引物

4.1.5产物酶切鉴定

4.1.6灵敏度检测及标准PCR方法的对比

4.1.7反应时间检测

4.1.8环引物Loop的验证

4.1.9特异性检测

4.1.10重复性和稳定性实验

4.2结果

4.2.1酶切鉴定结果

4.2.2灵敏度检测结果

4.2.3反应时间检测结果

4.2.4环引物Loop的作用

4.2.5特异性检测结果

4.3结论与讨论

4.3.1结论

4.3.2讨论

第五章全文结论

参考文献

致谢

作者简历