牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达与巢式RT-PCR检测方法的建立和应用

摘要

牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)是牛的主要疾病之一，可引起牛的生产性能下降而给养牛业造成重大经济损失。牛病毒性腹泻病毒基因组编码11种蛋白，其中E2蛋白是病毒主要的保护性抗原，能诱导中和抗体的产生，保护动物不受同源毒株的攻击。本试验用经序列测定已知的牛病毒性腹泻病毒BA毒株，接种MDBK细胞，提取病毒基因组RNA。根据BA毒株基因组序列，利用Oligo6生物学软件设计可以扩增E2蛋白的一对引物，引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1000bp的E2基因片段，克隆到pMD18-T载体上，酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体，转化BL21表达菌。取转化菌培养，并用IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白经变性、纯化、复性后，用Westernblotting、间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性，为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。 同时利用GenBank中已发表的BVDV基因组序列中5'端保守序列设计巢式引物。应用Oligo6软件设计了2对引物，一对为外部引物，预期扩增片段大小为294bp；一对为内部引物，预期扩增片段大小为1.54bp。经过Blast对比分析，这一对引物可以检测所有类型的BVDV、猪瘟病毒和边界病病毒。应用这两对引物，建立了BVDV的巢式RT-PCR检测方法。应用该方法检测了现地采集的牛血清、商品化的细胞培养用新生牛血清和成年牛血清、流产牛胎儿组织等样品，结合核苷酸序列分析表明该方法可以特异地检测BVDV和猪瘟病毒的RNA，该法灵敏、准确、快速，可用于BVDV等瘟病毒RNA的快速检测。通过对扩增片段的核苷酸序列分析与系统进化树分析，初步确定国内流行的BVDV主要为Ⅰ型，可分为4个不同的亚型，为国内BVDV的防治提供了技术支持。 本试验建立了BVDVRT-PCR诊断方法，并证明该方法不仅可以准确快速诊断BVDV，而且可以诊断BVDV同属的猪瘟病毒。同时利用pET30a表达载体成功克隆了BVDVE2基因，获得了以包涵体形式表达的目的蛋白。对包涵体蛋白进行了变性纯化，复性后依然具有良好的免疫原性。本实验利用建立的RT-PCR诊断方法，对国内BVDV感染情况做了一些基础性调查研究，希望能引起对本病的重视。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章绪论

引 言

1.1牛病毒性腹泻病毒概述

1.1.1历史回顾

1.1.2病原体

1.1.3 BVDV引起粘膜病的致病机理研究

1.1.4流行病学

1.1.5牛病毒性腹泻一粘膜病在我国的防制状况

1.2诊断方法研究进展

1.2.1 血清学诊断方法

1.2.2分子生物学实验技术

1.3牛病毒性腹泻新型疫苗研究

1.3.1病毒载体疫苗

1.3.2基因工程亚单位疫苗

1.3.3 DNA疫苗

1.4研究的目的和意义

第二章牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的截短表达与鉴定

2.1材料与方法

2.1.1克隆质粒、菌株及病毒、细胞与血清

2.1.2主要试剂

2.1.3主要的仪器设备

2.1.4 MDBK细胞的培养与病毒基因组RNA的提取

2.1.5 E2蛋白抗原性、亲水性和表面展示概率分析

2.1.6引物设计与合成

2.1.7 E2基因的RT-PCR扩增与表达载体的构建

2.1.8 pET30A-E2重组蛋白的表达及优化

2.1.9重组蛋白表达效率的测定

2.1.10表达形式的鉴定

2.1.11表达产物的纯化

2.1.12免疫印迹检测

2.1.13间接ELISA检测

2.2结果

2.2.1生物学软件分析结果

2.2.2 PCR及表达载体的鉴定

2.2.3诱导条件及其优化

2.2.4重组蛋白表达效率的测定结果

2.2.5表达蛋白在细菌中的存在形式

2.2.6表达蛋白的纯化

2.2.7免疫印迹分析

2.2.8不同血清样品的间接ELISA检测结果

2.3讨论

2.3.1 BVDV E2蛋白特性

2.3.2表达系统的选择

2.3.3包涵体纯化策略

2.3.4应用前景

第三章 牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

3.1材料与方法

3.1.1病毒与细胞

3.1.2试剂

3.1.3引物设计

3.1.4病毒RNA的提取

3.1.5反转录合成CDNA

3.1.6 RT-PCR反应条件的优化

3.1.7 PCR扩增体系与循环参数

3.1.8扩增产物的检测及鉴定

3.1.9 PCR交叉反应试验

3.1.10 PCR敏感性试验

3.1.11 PCR重复性试验

3.1.12待测样品RNA的制备与检测

3.2结果与分析

3.2.1病毒RNA的提取

3.2.2扩增产物的检测及鉴定

3.2.3交叉反应试验

3.2.4敏感性试验

3.2.5重复性试验

3.2.6试验样品的检测

3.3讨论

3.3.1 PCR检测基因的选择与引物的设计

3.3.2 RT-PCR反应的特异性

3.3.3 RT-PCR反应的敏感性

3.3.4影响RT-PCR试验成败的因素

3.3.5 RT-PCR诊断方法在牛感染BVDV病毒检测中的应用

第四章全文结论

参考文献

附录

致 谢

作者简历