副猪嗜血杆菌菌影(Ghost)的制备及其免疫效力评价

摘要

副猪嗜血杆菌病又称“革拉瑟氏病”(Gl(a)sser’s disease)是由猪上呼吸道的一种常在机会致治病菌,副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)在特定的条件下侵入机体,引起以浆液性、纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的传染性疾病。目前,随着规模化养猪业的发展,副猪嗜血杆菌病对养猪业的危害范围也正在扩大,给养猪业带来了巨大经济损失。现在,主要采用灭活疫苗防控此病。通过使用灭活疫苗,可以很好地控制某些血清型的发病,但由于Hps的血清型较多,且具有明显的地方性特征,灭活疫苗对不同血清型Hps的交叉保护效果十分有限或者是无效,因此新型疫苗的开发已经成为研究热点。
　　 菌影(bacterial ghost,BG)是一种不含细胞内容物的空胞体,只保留了和活菌一样的外膜结构,免疫原性高,又兼有佐剂的作用。在控制传染性疾病的研究中,菌影开始受到国内外研究者的关注。为了研制Hps的菌影疫苗,本实验根据GenBank中噬菌体PhiX174裂解基因E的编码序列设计引物,通过PCR方法扩增溶菌基因E。经克隆、鉴定后,将该基因与pBV220载体中的λPL／PR-cI857启动阻遏系统相串联,构成温度敏感的溶菌盒E-λPL／PR-cI857。再将含有E基因的溶菌盒亚克隆到pMD18-T载体中,构建Hps打孔质粒。采用电击穿孔法将其转入E.coliβ2155中,然后利用接合转移的方式将打孔质粒转入Hps血清5型菌株。含有打孔质粒的Hps在28℃条件下生长到对数生长期,然后升温到42℃诱导E基因的表达,成功制备了Hps菌影。电镜结果表明细菌内容物被释放到胞外且菌影形态完整,本实验为进一步研发有效的Hps菌影疫苗和佐剂形式奠定了基础。
　　 通过动物试验对制备的Hps菌影疫苗进行免疫效力检验。将Hps阴性血清的健康幼龄猪,随机分为6组,分别用不同的方式接种不同抗原进行免疫:实验Ⅰ组(菌影疫苗肌肉注射)、实验Ⅱ组(菌影疫苗滴鼻免疫)、实验Ⅲ组(加佐剂的菌影疫苗肌肉注射)、实验Ⅳ组(加佐剂的菌影疫苗滴鼻免疫)、实验Ⅴ组(灭活疫苗肌肉注射)、实验Ⅵ组(对照组,用无菌PBS免疫)。每组的接种剂量都为5×109CFU／头,一免三周后,用同样的剂量及方式进行加强免疫。10天后用Hps血清5型菌株按5×108 CFU／头的剂量进行腹腔攻毒,通过保护率、病理剖检、抗体检测、及间接免疫荧光等评价疫苗的免疫效果。结果表明,通过肌肉注射加有佐剂的菌影疫苗的免疫效果优于其他组。本研究为副猪嗜血杆菌病的防治提供了一种新的方法。