一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂

摘要

本发明公开了一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂。该免疫增强剂含有6‑PGD，IL‑8，IL‑6，葡萄糖和明胶，能够显著提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果。本发明还发现6‑PGD、IL‑6、IL‑8同时使用时对副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果产生了协同作用，其所发挥的促免疫效果高于6‑PGD、IL‑6、IL‑8分开使用产生的促进效果的和。本发明的免疫增强剂有利于促进副猪嗜血杆菌疫苗的广泛有效地应用，具有很好的应前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂。

背景技术

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的，是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等，发病率一般为10-15％，死亡率可达50％以上，给养猪业带来了巨大的经济损失，引起了人们的日益重视。

目前控制该病的有效方式是疫苗接种。文献报道商业疫苗或自家苗的使用可以控制副猪嗜血杆菌的感染。但是也有使用疫苗预防失败的实例，疫苗的免疫效果对于有效预防该病尤为重要。

高免疫效力的疫苗除了需要好的疫苗毒株，高浓度的抗原，佐剂对于提高疫苗的免疫效果也相当重要，好的免疫佐剂具有减少疫苗抗原剂量，降低疫苗成本等优势。本发明旨在研制一种能够提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果的免疫增强剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂。

本发明所采取的技术方案是：

一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂，其特征在于，该免疫增强剂由10～50份6-PGD，0.5～5份IL-8，0.3～5份IL-6，1～6份葡萄糖，2～8份明胶组成，所述份数均为质量份数。

进一步的，上述免疫增强剂由20～30份6-PGD，2～4份IL-8，1～3份IL-6，2～4份葡萄糖，4～6份明胶组成，所述份数均为质量份数。

一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂，该免疫增强剂含有10～50mg/mL6-PGD，0.5～5mg/mL IL-8，0.3～5mg/mL IL-6，1～6mg/mL葡萄糖，2～8mg/mL明胶，余量为无菌生理盐水。

进一步的，上述免疫增强剂含有20～30mg/mL 6-PGD，2～4mg/mL IL-8，1～3mg/mL IL-6，2～4mg/mL葡萄糖，4～6mg/mL明胶，余量为无菌生理盐水。

一种副猪嗜血杆菌疫苗混合物，该疫苗混合物中含有上述任一项所述的免疫增强剂。

进一步的，上述免疫增强剂的体积为副猪嗜血杆菌疫苗的1～15％。

6-PGD、IL-8和IL-6同时作为副猪嗜血杆菌疫苗免疫增强剂的应用。

进一步的，6-PGD、IL-8和IL-6的质量比例为(10～50)：(0.5～5)：(0.3～5)。

6-PGD、IL-8、IL-6、葡萄糖和明胶同时作为副猪嗜血杆菌疫苗免疫增强剂的应用。

进一步的，6-PGD、IL-8、IL-6、葡萄糖和明胶的质量比例为(10～50)：(0.5～5)：(0.3～5)：(1～6)：(2～8)。

本发明的有益效果是：

本发明发现6-PGD、IL-8和IL-6的同时使用能够显著提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果。本发明还发现6-PGD、IL-6、IL-8同时使用时对副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果产生了协同作用，其所发挥的促免疫效果高于6-PGD、IL-6、IL-8分开使用产生的促进效果的和。

本发明研究的含有10～50mg/mL 6-PGD，0.5～5mg/mL IL-8，0.3～5mg/mL IL-6，1～6mg/mL葡萄糖，2～8mg/mL明胶的免疫增强剂对副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果具有更佳的促进效果。本发明的免疫增强剂有利于促进副猪嗜血杆菌疫苗的广泛有效地应用，具有很好的应前景。

附图说明

图1为各组免疫仔猪血清中副猪嗜血杆菌IgG抗体水平，纵坐标为OD_450nm值；

图2为各组副猪嗜血杆菌IgG抗体水平，纵坐标为OD_450nm值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂

本实施例免疫增强剂由20份6-PGD蛋白(6-Phosphogluconate dehydrogenase,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)，2份IL-8蛋白，3份IL-6蛋白，3份葡萄糖，5份明胶组成，所述份数均为质量份数。

免疫增强剂的制备方法：蛋白质6-PGD、IL-8、IL-6、葡萄糖、明胶按上述配比配制、混匀，分装至青霉素瓶中，冻干保存备用，即可。

免疫增强剂的使用：

(1)使用时往免疫增强剂中加入相应量的无菌生理盐水，使各成分浓度分别为20mg/mL6-PGD，2mg/mL IL-8，3mg/mL IL-6，3mg/mL葡萄糖，5mg/mL明胶，得用生理盐水溶解后的免疫增强剂。

(2)将副猪嗜血杆菌疫苗中加入体积为疫苗体积6％的用生理盐水溶解后的免疫增强剂，即可。

实施例2一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂

本实施例免疫增强剂中含有10～50mg/mL 6-PGD蛋白(6-Phosphogluconate dehydrogenase,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)，0.5～5mg/mL IL-8蛋白，0.3～5mg/mL IL-6蛋白，1～6mg/mL葡萄糖，2～8mg/mL明胶，余量为无菌生理盐水。

免疫增强剂的制备方法：蛋白质6-PGD、IL-8、IL-6、葡萄糖、明胶按上述配比配制好后，分装至青霉素瓶中，冻干保存备用，使用时每瓶加入相应量的无菌生理盐水。

免疫增强剂的使用：将副猪嗜血杆菌疫苗中加入疫苗体积1～15％的用生理盐水溶解后的免疫增强剂。

实施例3副猪嗜血杆菌疫苗的制备

按现有常规技术制备副猪嗜血杆菌疫苗，具体操作方法如下：

1)一级种子液制备：取保存的副猪嗜血杆菌接种于TSA固体平板，在温度为37℃的条件下培养18h；然后挑取单菌落于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养18h，进行纯粹检验合格后，作为一级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天；

2)二级种子液制备：取步骤1)得到的一级种子液，按种子液与培养基的体积比1:20接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养16h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天；

3)原菌液制备：取步骤2)得到的二级种子培养液，按种子液与培养基的体积比1:100接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养24h后，得到原菌液；

4)活菌计数：将步骤3)中获得的菌液进行活菌计数，步骤如下：

将副猪嗜血杆菌接种于TSA固体培养基上，37℃培养12h左右，用pH 7.4PBS洗下菌苔后反复吹打混合均匀，再进行平板菌落计数：每个样品取1mL，用pH 7.4PBS做10倍系列稀释，每个稀释度换1支吸管。具体方法是：准确吸取菌液100μL，放入盛有稀释液900μL的第一支1.5mL离心管中(不接触液面)，另取1支1mL枪头将第一管液体混合均匀后，吸取100μL放入盛有稀释液900μL的第2支1.5mL离心管中，依次稀释至最后1管。根据对样品含菌数的估计，选择适宜稀释度，吸取最终稀释度的菌液接种适宜的培养基平板3个，每个滴100μL，使菌液散开，置37℃凉干后，翻转平板，培养48～72h，按照下列方法数出每个平皿中的菌落个数，计算每mL菌液中的活菌数(CFU/mL)。

5)灭活：在上述菌液中加入终浓度为0.2～0.4％的甲醛溶液，37℃振荡灭活24h。

6)乳化：在步骤5)得到的灭活菌液中取样，按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验；将原菌液在转速为8000rpm的条件下离心10min取沉淀的菌体，用无菌生理盐水重悬菌体后洗涤，经洗涤的菌体用生理盐水稀释成浓度为3×10⁹CFU/mL的制苗菌液，将制苗菌液与铝胶佐剂以体积比4：1～9：1混合，转速8000rpm的条件下乳化20min，得到副猪嗜血杆菌疫苗，2～8℃保存备用。

实施例4不同免疫佐剂的免疫增强效果比较研究

在本发明研究过程中，研究了大量的细胞因子作为免疫佐剂对副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果的影响，下面列举部分实验结果。

取30头10日龄仔猪，随机分成5组，每组5头，在上述实施例3制备的疫苗中分别加入下列A～E组免疫佐剂，F组为对照组(见表1)，将A～E组免疫佐剂直接免疫上述副猪嗜血杆菌疫苗，每头仔猪免疫2mL，15天后二免2mL/头，二免20天后进行攻毒，同时采血测定副猪嗜血杆菌抗体效价。

表1试验分组情况

注：表中的浓度均为细胞因子在疫苗中的终浓度。

各组免疫仔猪被攻毒后的发病情况如表2所示，从中可以看出，A、B组的中IL-2、IL-4、IFN-α、IFN-β作为副猪嗜血杆菌疫苗的免疫佐剂时，并没有对疫苗起到增强的作用，甚至不利于副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果的产生，加重了仔猪的发病情况。从表2中可以看出，C～E组没有发现仔猪发病，说明免疫佐剂有利于提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果。

表2各组免疫仔猪被攻毒后的发病情况

进一步检测各组免疫仔猪血清中副猪嗜血杆菌IgG抗体水平发现，如图1和表3所示，A(0.91)、B(0.95)组IgG抗体水平与疫苗对照组F组(0.91)相当，没有明显区别；C(1.18)、E(1.29)组的IgG抗体水平高于F(0.91)组，但不具有显著差异，D组的免疫效果显著高于F组，抗体水平达1.69，且高于C、E组2组促进效果的和，说明6-PGD、IL-6、IL-8同时使用时，产生了协同促进的效果，显著提高了副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果。

表3为各组免疫仔猪血清中副猪嗜血杆菌IgG抗体水平

组别IgG抗体水平(OD_450nm值)A0.91B0.95C1.18D1.69E1.29F0.91

实施例5本发明免疫增强剂的免疫效果检测

在上述制备的副猪嗜血杆菌疫苗中按疫苗体积1～15％的比例添加本发明实施例1中用生理盐水溶解的免疫增强剂，充分振荡混匀后即可使用。取10日龄仔猪25头，随机分成5组，A～E组，每组5头，分别按表4所述的体积添加量(0％、1％、5％、10％、15％)将免疫增强剂添加到副猪嗜血杆菌疫苗中，然后对仔猪进行免疫，2mL/头，15天后进行二免，2mL/头，二免后20天进行攻毒或取血液测定抗体水平，比较免疫效果。

表4各组免疫仔猪被攻毒后的发病情况

表5各组副猪嗜血杆菌IgG抗体水平

组别IgG抗体水平(OD_450nm值)A0.91B1.12C1.56D1.69E1.59

从表4、5和图2的检测结果中可以看出，按疫苗体积1～15％添加本发明免疫增强剂，可有效提高副猪嗜血杆菌疫苗的免疫效果，其中当添加量为10％时效果最佳。

实施例6一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂

本实施例免疫增强剂由10份6-PGD蛋白，0.6份IL-8蛋白，5份IL-6蛋白，6份葡萄糖，2份明胶组成，所述份数均为质量份数。

免疫增强剂的制备方法：蛋白质6-PGD、IL-8、IL-6、葡萄糖、明胶按上述配比配制、混匀，分装至青霉素瓶中，冻干保存备用，即可。

免疫增强剂的使用：

(1)使用时往免疫增强剂中加入相应量的无菌生理盐水，使各成分浓度分别为10mg/mL6-PGD，0.6mg/mL IL-8，5mg/mL IL-6，6mg/mL葡萄糖，2mg/mL明胶，得用生理盐水溶解后的免疫增强剂。

(2)将副猪嗜血杆菌疫苗中加入体积为疫苗体积15％的用生理盐水溶解后的免疫增强剂，即可。

实施例7一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂

本实施例免疫增强剂由50份6-PGD蛋白(6-Phosphogluconate dehydrogenase,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)，5份IL-8蛋白，0.3份IL-6蛋白，1份葡萄糖，8份明胶组成，所述份数均为质量份数。

免疫增强剂的制备方法：蛋白质6-PGD、IL-8、IL-6、葡萄糖、明胶按上述配比配制、混匀，分装至青霉素瓶中，冻干保存备用，即可。

免疫增强剂的使用：

(1)使用时往免疫增强剂中加入相应量的无菌生理盐水，使各成分浓度分别为50mg/mL6-PGD，5mg/mL IL-8，0.3mg/mL IL-6，1mg/mL葡萄糖，8mg/mL明胶，得用生理盐水溶解后的免疫增强剂。

(2)将副猪嗜血杆菌疫苗中加入体积为疫苗体积1％的用生理盐水溶解后的免疫增强剂，即可。

实施例8一种提高副猪嗜血杆菌疫苗免疫效力的免疫增强剂

本实施例免疫增强剂中含有30mg/mL 6-PGD蛋白(6-Phosphogluconate dehydrogenase,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)，4mg/mL IL-8蛋白，1mg/mL IL-6蛋白，2mg/mL葡萄糖，4mg/mL明胶，余量为无菌生理盐水。

免疫增强剂的制备方法：蛋白质6-PGD、IL-8、IL-6、葡萄糖、明胶按上述配比配制好后，分装至青霉素瓶中，冻干保存备用，使用时每瓶加入相应量的无菌生理盐水。

免疫增强剂的使用：将副猪嗜血杆菌疫苗中加入疫苗体积8％的用生理盐水溶解后的免疫增强剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。