胸膜肺炎放线杆菌菌影（Ghost）的制备及其免疫效力评价

摘要

本实验通过PCR技术扩增噬菌体PhiX174的溶菌基因E，将该基因连接到含有λPL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220载体中，从而使溶菌基因E和启动阻遏系统λPL/PR-C1857串联成为温度敏感的溶菌盒E-λPL/PR-C1857，构建重组质粒pBV-E。再将含有E基因的溶菌盒插入到App-E.coli穿梭载体pGZRS-18中，成功地构建App-E.coli穿梭溶菌质粒pGZRS-Eλ。采用电击穿孔法将其转入胸膜肺炎放线杆菌APP1型shope4074菌株中，含有裂解质粒的胸膜肺炎放线杆菌在280c条件下生长到对数生长期，然后添加氯霉素至终浓度1μg/ml，升温剑42℃诱导其溶解，制成了胸膜肺炎放线杆菌菌影。电镜观察菌影细胞形态完整保持了细菌的基本细胞形态，内容物全部被释放到胞外，细胞表面发生明显的皱缩。本实验构建的溶菌质粒pBV-E和pGZRS-Eλ在各自宿主菌中的溶菌效率分别达到了99.86％和99.99％。本实验为进一步研究菌影这一新型菌苗及佐剂形式奠定了基础。 将胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗以5×109cfu/只的剂量分两种方式对实验猪进行免疫：实验Ⅰ组(肌肉注射免疫组)、实验Ⅱ组(滴鼻免疫组)和对照组，实验组每组6只，对照组4只。进行猪的免疫攻毒保护实验。免疫共分2次，每次间隔两周。第2次免疫后第14d，分别以APP1型菌(5x109cfu)和APP2型菌(5×109cfu)进行攻毒。以APP1全菌体为包被抗原，间接ELISA方法检测血清抗体水平。结果表明，1免1周后肌肉注射APPGhosts免疫后猪血清抗体水平明显上升，与滴鼻免疫组和对照组相比差异显著(p＜0.05)。1免2周抗体水平略有下降，2免1周后抗体水平明显上升。2免2周后肌肉注射免疫组抗体水平略有上升，与滴鼻免疫组和对照组相比差异极显著(p＜0.01)。而滴鼻免疫组与对照组的差异始终不显著(p＞0.05)。攻毒2周后，根据攻毒后猪的存活率、肺脏病理变化及间接免疫荧光检测，综合评价胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗的免疫保护效果。结果表明，通过肌肉注射胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗可以激发动物体内产生较好的免疫应答，并明显优于滴鼻免疫组。本研究制备的胸膜肺炎放线杆菌菌影具有良好的应用前景，为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1猪传染性胸膜肺炎的流行与危害

1.1.1病原学

1.1.2流行病学

1.1.3临床症状和病理变化

1.1.4实验室诊断方法

1.1.5预防

1.2猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展

1.2.1灭活疫苗

1.2.2弱毒活疫苗

1.2.3亚单位疫苗

1.2.4 Ghosts疫苗

1.3研究目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1质粒与菌株

2.1.2实验动物

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器设备

2.2试验方法

2.2.1 DH5α"Bacterial Ghost"的制备

2.2.2胸膜肺炎放线杆菌菌影的制备

2.2.3胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗的制备

2.2.4猪的免疫及攻毒

2.2.5血清特异性抗体的检测

2.2.6攻毒后猪肺脏病理变化

2.2.7间接免疫荧光进行肺脏的抗原定位试验

2.2.9数据处理

3结果与分析

3.1目的基因的克隆与序列测定结果

3.1.1裂解基因E的PCR扩增

3.1.2重组质粒pMD18-E和溶菌质粒pBV-E的鉴定

3.1.3溶解盒基因(E-λPL/PR-cI857)的扩增

3.1.4穿梭溶菌质粒pGZRS-Eλ的PCR鉴定

3.2 APPE的PCR鉴定结果

3.3溶菌质粒溶菌的最佳条件

3.3.1菌液OD600nm值和诱导时间对细菌裂解率的影响

3.3.2氯霉素对宿主菌的影响

3.4诱导后的细菌生长曲线

3.5裂解率计算的结果

3.5.1大肠杆菌工程菌株DH5α的裂解率

3.5.2胸膜肺炎放线杆菌的裂解率

3.6电镜观察结果

3.6.1大肠杆菌菌影的电镜观察结果

3.6.2胸膜肺炎放线杆菌菌影的电镜观察结果

3.7猪血清特异性抗体的动态变化

3.8猪攻毒后的保护情况

3.8.1猪攻毒后的保护情况

3.8.2猪攻毒后的体温检测

3.8.3猪攻毒后的病理解剖学变化

3.8.4猪攻毒后肺脏组织学病变

3.8.5猪攻毒后肺脏间接免疫荧光结果

4讨论

4.1溶菌质粒在氯霉素作用下的溶菌情况

4.2诱导前菌液浓度对细菌裂解的影响

4.3胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗刺激猪体内产生的抗体水平

4.4胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗对猪的保护作用

5结论

致谢

参考文献

附录E基因测序结果序列(seq)与期望序列(exp)的比对

攻读硕士学位期间发表的学术论文