牛X-、Y-精子消减Cdna文库的筛选及差异表达基因的分析

摘要

雄性哺乳动物可同时产生X-、Y-精子,研究两种精子的转录本对于揭示精子发育过程中的基因表达具有重要理论意义,同时在家畜性别控制技术研究中也具有重要的地位。传统观点认为,相邻精子的基因表达产物通过细胞间桥被共享,检测两种性别精子的表达差异已没有意义,然而目前没有证据表明细胞间桥使所有的表达产物共享。为研究X-、Y-精子间基因表达差异情况,本实验室前期构建了牛X-、Y-消减cDNA文库。本研究采用芯片技术与序列同源性分析相结合的方法对文库中的差异表达基因进行筛选和分析,并通过real-time RT-PCR方法验证了芯片结果的准确性。
　　 1.牛X-、Y-精子消减cDNA的筛选
　　 采用cDNA芯片技术对已构建的牛X-、Y-精子消减cDNA文库进行筛选。根据文库的序列中信息,选取201个代表所有unigenes clones的PCR纯化产物点制了cDNA芯片；分别制备X-、Y-精子总RNA,并进行两轮mRNA线性扩增,将得到的aRNA反转录为cDNA,再对cDNA进行荧光标记；将cDNA芯片与标记的cDNA杂交。采用SAM软件分析3张生物学重复芯片的数据,获得31个阳性差异表达clones,即阳性差异表达unigenes,其中4个在Y-精子中上调,27个在X-精子中上调。
　　 2.差异表达基因的序列同源性分析
　　 对经过芯片杂交验证的阳性差异表达基因的Blastx比对结果显示,有12.9％的unigenes(4个contigs)与SwissProt数据库中注释的蛋白质高度同源(E-value≤1×10-10),其中1个基因在Y-精子中上调,3个基因在X-精子中上调,并且这4个基因都与精子的基础生命活动相关。对剩余差异表达基因的Blastn比对结果显示,32.26％的unigenes(7个contigs和3个singlets)与牛EST数据库中的序列高度同源(E-value≤1×10-10),认为是未知功能的基因,其中1个基因在Y-精子中上调,9个基因在X-精子中上调。其余54.84％的unigenes在数据库中未找到同源序列(E-value≥1×10-10),认为可能是新基因。
　　 3.Real-time RT-PCR对两个基因表达情况的检测
　　 对阳性差异表达基因细胞色素b基因(Cytochrome b,CYTB)和铁硫簇支架蛋白基因(Iron-sulfur cluster scaffold.ISCU)在X-、Y-精子中的表达情况进行检测,结果显示两个基因在X-精子中的表达量分别是在Y-精子中的1.731倍和5.126倍,验证了芯片筛选的准确性。
　　 本研究证明了在细胞间桥存在的前提下,X-、Y-精子间仍然存在差异基因表达产物,为进一步研究精子发育过程中的基因表达奠定了理论基础,同时为深入进行X-Y-精子转录水平和蛋白水平的基因表达研究提供理论依据和技术支撑。