计算机辅助分子设计提高蛋白质热稳定性的研究

摘要

酶作为天然的生物催化剂,具有高催化效率和高底物选择特异性的特点,在工业生产上拥有巨大的应用潜力和良好的发展前景。但是许多酶分子对工业生产中热处理的耐受性较差,严重制约了它们在工业生产中的应用。因此研究蛋白质的热稳定机制与通过理性设计提高蛋白质的热稳定性一直是计算生物学及蛋白质工程领域中的一个研究热点。这对扩大酶的应用范围与探究蛋白质结构和功能的关系均具有重要意义。
　　 本研究中我们设计了两个策略分别从微观与宏观两方面分析确定了影响蛋白质热稳定性的关键氨基酸,并以来源于Ochrobactrum sp.M231的甲基对硫磷水解酶(MPH-Ochr)为研究对象,利用实验来验证设计策略的有效性。
　　 策略一为创新性的将分子动力学模拟应用到蛋白质热稳定性的研究中。其计算步骤主要包括首先利用分子动力学模拟来寻找蛋白质活性中心以外的构象不稳定区段,查找构象不稳定区段内部或其附近的柔性氨基酸(如甘氨酸),并将这些柔性氨基酸突变为刚性氨基酸(如脯氨酸),再利用分子动力学模拟来验证这些突变对构象不稳定区段的影响,即对蛋白质热稳定性的影响。将该策略应用到MPH—Ochr,首先通过分子动力学模拟发现在该酶的第186-193位氨基酸的构象非常不稳定,并且这些氨基酸不在蛋白质的活性中心,经序列分析发现在该区段的下游存在两个甘氨酸(G194及G198),通过同源模建模拟了三个突变体(G194P,G194P／G198P及G198P)的三维结构,再利用分子动力学模拟来验证这些突变的效果,发现只有突变G194P能明显提高区段186—193的构象稳定性。将野生型与三个突变体的基因进行表达、蛋白质纯化并测定各自的热稳定性,实验结果与计算结果基本一致,G194P的Tm值与750分别比野生型提高了3.3℃与4.6℃。热动力学数据分析发现G194P的焓变和野生型相当,但其熵变比野生型更低,这表明其受热处理时构象更加稳定。这些实验结果表明该策略是有效的针对蛋白质进行热稳定性改造的分子设计方法。
　　 策略二为通过计算突变体和野生型蛋白质解折叠自由能的差值(△△G)和其正负类别来筛选可能会影响蛋白质热稳定性的位点。在本研究中我们设计了新的一个基于蛋白质结构的预测突变对蛋白质热稳定性影响的具体数值(即:△△G值)和其正负类别的软件Prethermut。该软件有两个主要的特征,其一为它可以预测单点与多点突变对蛋白质热稳定性的影响；其二为首次在特征设计的过程中引入了一个蛋白质标准特征,将突变体的结构特征和这个蛋白质标准特征进行比较,而不是直接将突变体的结构特征和野生型蛋白质的结构特征进行比较。用数据集S-dataset来测试该软件的性能,并将其与一些常用的类似软件进行比较,结果表明该软件无论是分类预测的能力还是回归预测的能力均优于已有的常用软件。
　　 我们同样将该策略应用于MPH-Ochr来提高该酶的热稳定性并检验该策略的有效性。利用蛋白质的位点进化熵(E),Prethermut的分类预测结果以及回归预测结果,筛选到可能不影响该酶的功能但可能会改善其热稳定性的7个氨基酸位点。在这7个位点构建定点饱和突变体库,从中筛选出阳性克隆,再评估突变对蛋白质热稳定性的影响,结果表明有6个突变体库均可以筛选得到热稳定性较野生酶提高的突变体。这些实验结果表明利用该策略筛选影响蛋白质热稳定性位点的方法是行之有效的。
　　 根据筛选到的6个突变体库中的单点突变信息,进行多点组合突变。组合突变的策略为先将筛选突变体文库获得的6个突变体按照热稳定性提高程度进行排序,然后在最优的单点突变体的基础上进行双点突变(突变位点为热稳定性第二优的突变位点),然后在最优的双点突变体的基础上进行三点突变(突变位点为热稳定性第三优的突变位点),再在三点突变体的基础上进行四点突变(突变位点为热稳定性第四优的突变位点)。最终筛选到一株热稳定性最优的四点突变体(274-183-197-192,S274Q／T183E／K197L／S192M),该突变酶的Tm值和T50分别较野生酶提高了11.7℃和10.2℃。该结果表明将蛋白质的单点突变进行合理组合可以更大幅度提高蛋白质的热稳定性。