C型口蹄疫病毒结构蛋白的原核表达及免疫原性分析

摘要

口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)所引起的口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是一种能够主要感染偶蹄目动物的烈性、热性、高度接触性传染病,因其严重影响世界动物贸易,所以一直受到世界各国的广泛重视。C型FMD较其他血清型的FMD流行范围较小,但在我国周边国家都有过流行史,因此有必要对其疫苗加强研究,以作为战略储备。
　　 使用灭活疫苗仍是控制FMD的主要手段,但是其在生产、运输、使用中存在着安全问题和不便,因此开发新型疫苗是解决这些问题的有效途径。基因工程亚单位疫苗是最安全的疫苗类型之一,目前主要使用各种表达系统对FMD的结构蛋白进行表达制备免疫原。本实验使用大肠杆菌表达系统表达C型FMD结构蛋白,制备免疫原。因为是大肠杆菌表达系统表达量大、产物纯化便利、成本低廉。在试验中,我们使用了pET-30a、pET-32a、pGEX-6p-1三种表达载体来表达C型FMD各结构蛋白(VP1、VP3和VP0)。并尝试使用不同诱导温度及不同诱导剂浓度来摸索C型FMD结构基因在大肠杆菌表达系统中潜在的可溶性表达条件。结果表明,在所试验条件下各结构蛋白均以包涵体形式表达。
　　 后将重组菌液pET-30VP1、pET30VP3、pET-30VP0进行收集,并使用含有低浓度变性剂(2M尿素溶液)对所表达包涵体进行洗涤,SDS-PAGE显示洗涤效果良好,得到纯度较高的包涵体。使用8M尿素溶液对洗涤后的包涵体进行溶解,SDS—PAGE显示三种融合蛋白包涵体均能很好溶解于尿素溶液中,使用透析复性的方法对变性后包涵体进行复性。其中pET-30VP1和pET-30VP3成功复性,并且复性产物经Western-blotting检测具有良好反应原性。pET-30VP0在透析过程中再次以聚集形式析出,复性以失败而告终。
　　 猪α-干扰素(Porcine interferon-α,poIFN-α)经报道证实能有有效刺激机体的免疫反应并能够抑制FMDV的增殖,因此本实验选择用大肠杆菌表达系统表达猪IFN-α作为疫苗的辅助刺激因子,以增强疫苗免疫性。
　　 复性后的VP1与VP3联合免疫小鼠,可以获得较高的特异性抗体水平。猪IFN-α在小鼠实验中并未达到预期的免疫增强效果,在本体动物上是否有增强疫苗免疫效果的作用还需实验证明。
　　 总之,大肠杆菌表达的C型FMDV结构蛋白VP1、VP3在经过复性后具有良好的免疫原性,为进一步基因工程亚单位疫苗的研制奠定了实验基础。