O型口蹄疫病毒缅甸98株空衣壳表达及免疫原性分析

摘要

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，主要侵害猪、牛、羊等偶蹄动物，疾病的发生对畜牧业造成巨大损害。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国也将其列在一类传染病之首。目前，接种疫苗是防控FMD的有效手段，FMD灭活疫苗在FMD的防控过程中发挥着不可替代的作用。常规灭活疫苗是毒株经病毒培养扩增，灭活剂处理后添加佐剂制成的，其生产过程存在灭活不完全和散毒的风险。病毒空衣壳包含了完整病毒上的所有免疫显性位点，且不含核酸成分，因而具有更高的安全性，是一种能替代灭活病毒制造疫苗的新型免疫原。
　　本研究以近年来流行的O型FMDV缅甸98株（O/MYA98/BY/2010株）为研究对象，构建了表达缅甸98株衣壳蛋白的杆状病毒，并通过查阅相关文献和参照本实验室FMDV O型ON株酸化培养的结果，进一步构建了两组在FMDV P1序列包含不同耐酸定点突变的衣壳蛋白表达重组杆状病毒。三组重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞成功表达并收集重组衣壳蛋白，通过间接免疫荧光试验、蛋白免疫印迹、双抗夹心酶联免疫吸附试验等多种方法检测到重组衣壳蛋白的表达，且具有良好的抗原性。经过耐酸定点突变的两组衣壳蛋白也表现出相应的耐酸作用。将重组衣壳蛋白混合GEL佐剂制成疫苗，免疫小鼠后能够刺激机体产生与灭活疫苗一致甚至更高的抗体水平，免疫豚鼠攻毒保护试验则表明，三组重组衣壳蛋白制成的疫苗能够发挥与灭活疫苗相似或更好的保护作用，试验进一步证实了空衣壳疫苗作为新型疫苗的可行性，为构建耐酸FMDV衣壳蛋白及其空衣壳疫苗的深入研究提供参考。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1 研究背景

1．2 口蹄疫

1．2．1 口蹄疫常见临床症状

1．2．2 口蹄疫的危害

1．3 口蹄疫病毒

1．3．1 FMDV基因组

1．3．2 FMDV血清型

1．4 口蹄疫疫苗研究进展

1．4．1 传统疫苗

1．4．2 新型疫苗

1．5 杆状病毒表达系统

第二章 重组杆状病毒的构建

2．1 实验材料与方法

2．1．1 细胞和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 引物设计与合成

2．1．5 重组杆状病毒转移载体的构建及定点突变

2．1．6 重组杆状病毒转座子的构建

2．1．7 转染昆虫细胞构建重组杆状病毒

2．2 实验结果

2．2．1 目的基因的扩增及鉴定

2．2．2 重组杆状病毒转移载体的构建及定点突变的鉴定

2．2．3 重组杆状病毒转座子的构建及其鉴定

2．2．4 重组杆状病毒的构建及其鉴定

2．3 讨论

第三章 O型口蹄疫病毒缅甸98株衣壳蛋白的表达及分析

3．1 实验材料与方法

3．1．1 细胞及病毒

3．1．2 主要试剂及抗体

3．1．3 主要仪器

3．1．6 Western-Blot检测重组衣壳蛋白

3．1．7 双抗夹心ELISA检测重组衣壳蛋白的抗原性

3．1．8 重组衣壳蛋白的蔗糖密度梯度纯化及双抗夹心ELISA鉴定

3．1．9 重组空衣壳的电镜观察及耐酸性检测

3．2 实验结果

3．2．1 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达

3．2．2 重组衣壳蛋白的Western-Blot检测分析

3．2．3 双抗夹心ELISA检测重组衣壳蛋白的抗原性

3．2．4 重组衣壳蛋白的纯化

3．2．5 重组空衣壳的观察及耐酸检测

3．3 讨论

第四章 O型口蹄疫病毒缅甸98株衣壳蛋白免疫动物实验

4．1 实验材料与方法

4．1．1 实验动物

4．1．2 病毒

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器

4．1．5 疫苗的制备

4．1．6 疫苗免疫小鼠试验

4．1．7 疫苗免疫豚鼠的攻毒保护试验

4．2 实验结果

4．2．1 小鼠免疫后抗体效价检测

4．2．2 豚鼠免疫后抗体水平变化

4．2．3 豚鼠攻毒保护结果

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历