致病性坏死梭杆菌120ku血凝素相关外膜蛋白基因的克隆及其特性分析

摘要

坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）是一种严格厌氧的革兰氏阴性杆菌，具有多形性，常引起人的急性咽炎综合征(Lemierre's Syndrome)和牛、羊、鹿等动物的腐蹄病、肝脓肿、坏死性皮炎、犊牛白喉。目前还没有商品化的坏死梭杆菌疫苗，国内外主要使用抗生素来治疗该病，但是抗生素带来的负面影响越来越受到人们重视，为了研究120ku血凝素相关外膜蛋白的生物学特性，并揭示其作为基因工程亚单位疫苗预防坏死杆菌病的可行性，本研究根据已报道的F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列，克隆出该基因完整的核苷酸序列，生物信息学分析了该蛋白的分子特征，参考抗原表位预测结果，将F.necrophorum120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的开放阅读框(Open reading frame)分为3个彼此重叠的基因片段p1、P2、p3，进行原核表达，纯化的重组蛋白P1、P2、P3分别免疫实验兔，检测兔血清中特异性抗体水平，主要研究内容如下:
　　1.根据已报道的F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列(登录号:AF529887.1)，采用染色体步移技术，克隆出该基因完整的核苷酸序列并用高保真酶进行验证，全长4247bp，含有一个3372 bp的ORF，编码1123个氨基酸，蛋白质的分子质量约为120ku。生物信息学分析表明，该蛋白可能是具有血凝活性的外膜自转运蛋白家族成员，并具有较强的抗原性。
　　2.F.necrophorum120 ku血凝素相关外膜蛋白的原核表达及纯化。参考抗原表位预测结果，将F.necrophorum120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的ORF分为3个彼此重叠60 bp左右的基因片段p1、p2、p3，构建重组表达载体pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3，在大肠杆菌中进行诱导表达，利用AKTA purifier蛋白纯化系统获得48 ku、59 ku、62 ku的重组蛋白P1、P2、P3，Western blot分析显示，纯化后的重组蛋白P1、P2、P3具有良好的反应原性。
　　3.将纯化的重组蛋白P1、P2、P3分别免疫实验兔，检测兔血清中的特异性抗体，结果显示，兔血清中的抗体效价分别为1∶32、1∶16、1∶16，表明重组蛋白均可诱导实验兔产生特异性抗体，具有良好的免疫原性。
　　综上所述，F.necrophorum120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的克隆及其免疫原性的初步分析，为进一步了解120ku血凝素相关外膜蛋白的生物学功能提供理论基础，并为基因工程亚单位疫苗和诊断制剂的研制提供了物质材料。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 坏死梭杆菌概述

1．1．1 坏死梭杆菌病原特征

1．1．2 坏死梭杆菌的致病机理

1．1．3 坏死梭杆菌的检测

1．2 未知基因的克隆

1．2．1 探针法

1．2．2 接头法

1．2．3 差减杂交

1．2．4 图位克隆

1．2．5 同源克隆

1．2．6 反向PCR

1．2．7 cDNA末端快速扩增

1．3 本研究的目的及意义

第二章 致病性坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的克隆与生物信息学分析

2．1 材料与方法

2．1．1 菌种、载体和试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 引物设计与合成

2．1．4 FN(AB)基因组DNA的提取

2．1．5 YN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因5’端旁侧序列的克隆与测序

2．1．6 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因3’端旁侧序列的克隆与测序

2．1．7 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因5’端旁侧序列的验证

2．1．8 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因3’端旁侧序列的验证

2．1．9 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因的序列分析

2．1．10 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白的生物信息学分析

2．2 结果与分析

2．2．1 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因5’端旁侧序列的克隆与测序

2．2．2 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因3’端旁侧序列的克隆与测序

2．2．3 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因5’端旁侧序列的验证

2．2．4 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因3’端旁侧序列的验证

2．2．5 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白基因的序列分析

2．2．6 FN(AB)血凝素相关外膜蛋白的生物信息学分析

2．3 讨论

第三章 致病性坏死梭杆菌120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的分段克隆及表达载体的构建

3．1 材料与方法

3．1．1 菌种与载体

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 引物设计与合成

3．1．5 基因片段p1、p2、p3的PCR扩增

3．1．6 基因片段p1、p2、p3 PCR产物的回收

3．1．7 重组克隆质粒的构建

3．1．8 重组克隆质粒转化E．coli Tmns T1

3．1．9 重组克隆质粒的提取

3．1．10 重组克隆质粒的PCR鉴定

3．1．11 重组克隆质粒的双酶切鉴定

3．1．12 重组克隆质粒的测序鉴定

3．1．13 重组表达质粒的构建

3．1．14 重组表达质粒转化E．coli Trans T1

3．1．15 重组表达质粒的提取

3．1．16 重组表达质粒的PCR鉴定

3．1．17 重组表达质粒的双酶切鉴定

3．1．18 重组表达质粒的测序鉴定

3．1．19 重组表达质粒转化BL21(DE3)plysS

3．1．20 重组表达质粒的提取与鉴定

3．2 结果与分析

3．2．1 基因片段p1、p2、p3的扩增

3．2．2 重组克隆质粒的PCR鉴定

3．2．3 重组克隆质粒的双酶切鉴定

3．2．4 重组克隆质粒的测序鉴定

3．2．5 重组表达质粒的PCR鉴定

3．2．6 重组表达质粒的双酶切鉴定

3．2．7 重组表达质粒的测序鉴定

3．3 讨论

第四章 致病性坏死梭杆菌120 ku血凝素相关外膜蛋白的原核表达及纯化

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．1．3 重组原核表达质粒在大肠杆菌中最适表达条件的筛选

4．1．4 SDS-PAGE分析

4．1．5 P1、P2、P3的大量表达

4．1．6 P1、P2、P3的分离纯化

4．1．7 Western blot分析

4．2 结果与分析

4．2．1 重组原核表达质粒在大肠杆菌中最适表达条件的摸索

4．2．2 纯化产物P1、P2、P3的SDS-PAGE分析

4．2．3 Western blot分析

4．3 讨论

第五章 致病性坏死梭杆菌重组120 ku血凝素相关外膜蛋白的兔体免疫试验

5．1 材料与方法

5．1．1 主要试剂及实验动物

5．1．2 主要仪器

5．1．3 抗原的制备

5．1．4 动物分组及免疫程序

5．1．5 兔血清的抗体检测

5．2 结果与分析

5．2．1 兔血清的抗体检测

5．3 讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

附录

作者简历