禽肿瘤病混感病例中REV基因序列分析及LTR重组MDV的鉴定

摘要

鸡马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒(MDV)引起的一种鸡的传染性、肿瘤性疾病，可导致其主要宿主鸡的免疫抑制和以淋巴细胞增生为特征的肿瘤发生，直至死亡。禽网状内皮组织增生病(RE)是另一种致瘤性的疾病，其病原为禽网状内皮组织增生症病毒(REV)，能引起鸡、火鸡、鸭和其他禽类的慢性肿瘤、矮小综合征及免疫器官萎缩等临床症状。近些年来，我国MDV和REV混合感染的病例逐渐增加，二者混合感染导致宿主更早的发病，临床症状更加严重。此外，污染REV的MD疫苗也是RE流行的一个重要来源。这些问题增加了MD和RE的防控难度。疱疹病毒MDV与逆转录病毒REV在体内和体外混合感染，会发生REV基因组，尤其是它的LTR序列片段在MDV基因组的整合。LTR具有启动子和增强子的活性，可调控MDV某些的基因表达，导致MDV的致病性和水平传播能力等生物学特性的改变，对MDV的演化具有重要意义。本研究从山东省和辽宁省2个发生肿瘤病的养鸡场采集病料，经琼脂扩散试验和PCR检测证实2个鸡群发生的均为MD。进一步的检测显示，2个鸡群存在REV的混合感染。为了进一步研究混感病料中REV的分子特征，我们在DF-1细胞上进行了REV的病毒分离，获得了2株REV病毒株。获得的毒株利用PCR、间接免疫荧光(IFA)和电镜观察等方法进行了鉴定。分离到的2株REV分别命名为CY1111株和SY1209株。在此基础上，对CY1111株和SY1209株进行了前病毒基因组测序，并与其他已发表的REV分离株进行序列比对和遗传进化分析。根据基因组不同区域的序列构建了LTR、gag基因、pol基因、env基因和全基因的遗传进化树。遗传进化树分析显示:我们获得的2株REV分离株和其他中国分离株，除GD1210株外，均位于同一个进化分枝，表明我国REV分离株之间具有较高的遗传进化相关性。值得注意的是，我们分离的REV CY1111株和SY1209株，与来源于MD商品疫苗中的MD-2毒株之间序列相似性达到99.8％，遗传进化分析也显示它们位于同一个分枝，推测两个鸡场中的REV可能来源于疫苗污染，这提示我们应加强对MD疫苗的质量控制。此外，进化分析的结果现实REV分离株并没有表现出宿主或地域的特异性，在自然条件下，REV可能能够自由地在不同宿主以及不同地域之间传播。
　　为了研究REV在MDV基因组中整合的发生，我们采用一种检测REV LTR在MDV基因组中整合的HS-cPCR(Hot Spot Combined PCR)方法，用于检测REV LTR在MDV中重组的热点位置。应用该方法对REV和MDV在体内和体外混合感染过程中的病毒之间的插入重组进行了检测。MDV LCY-BAC株为本实验室在混感REV的MDV野毒株分离过程中获得的毒株，该毒株经细菌人工染色体技术(BAC)进行了病毒纯化。对其检测发现，MDV LCY-BAC株基因组中存在两个REV的完整LTR序列插入，插入位置分别在基因组的短独特区(Us)两侧与内部短重复区(IRs)和末端短重复区(TRs)交接处，而且这两个LTR的插入方向相同，均为反向插入到MDV基因组。为研究这种重组病毒的遗传稳定性，将LCY-BAC株体外传至15代，对第2、5、8、12和15代分别进行了检测，结果发现LTR插入的位置、方向和拷贝数均没有发生变化，证明具有这种REV LTR插入的重组MDV毒株能够在体外稳定遗传，对研究MDV和REV之间的重组具有重要意义。通过HS-cPCR检测来自8个不同鸡群的确诊为MDV和REV混合感染的病鸡样品，并没有发现有LTR重组的现象，说明自然发生LTR重组MDV的几率可能较低。本研究对混合感染病料中的REV进行了病毒分离、鉴定和遗传进化分析，发现我国REV毒株遗传进化关系接近，并且推测疫苗污染是REV的一种可能的来源。REV重组MDV的分析研究发现了REV LTR一种新的重组插入方式和插入位置，并且这种新的重组病毒在体外具有良好的遗传稳定性;对一定数量的自然混感病例的检测未发现自然重组的野毒株。本研究为两种主要禽肿瘤病原的重组、演化以及它们的防控提供了一些重要的研究数据和理论依据。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 鸡马立克氏病

1．1．1 鸡马立克氏病及鸡马立克氏病病毒概述

1．1．2 马立克氏病病毒基因组

1．1．3 鸡马立克氏病的流行病学

1．2 禽网状内皮组织增生症

1．2．1 禽网状内皮组织增生症及禽网状内皮组织增生症病毒概述

1．2．2 REV基因组及其复制

1．2．3 REV的流行病学

1．3 MDV与REV的混合感染与重组

1．3．1 混合感染

1．3．2 REV LTR重组MDV基因组

1．4 研究的目的与意义

第二章 混感病例中两株REV的分离鉴定及其基因组序列分析

2．1 材料

2．1．1 病料、载体、细胞和菌株

2．1．2 主要试剂与仪器设备

2．2 方法

2．2．1 病料的处理

2．2．2 总DNA的提取

2．2．3 MDV和REV的PCR检测

2．2．4 REV的分离及鉴定

2．2．5 REV前病毒DNA的提取

2．2．6 REV全基因组序列的分段扩增及克隆

2．2．7 全基因组序列的拼接及分析

2．3 结果

2．3．1 病料中MDV和REV的检测

2．3．2 2株REV病毒的分离和鉴定

2．3．3 REV全基因组的PCR扩增与克隆

2．3．4 REV基因组的序列分析

2．3．5 REV的遗传进化分析

2．4 讨论

第三章 REV LTR重组MDV基因组的检测

3．1 材料

3．1．1 细胞、毒株、病料

3．1．2 主要试剂和仪器设备

3．2 方法

3．2．1 引物设计及HS-cPCR方法

3．2．2 MDV LCY-BAC株重组REV LTR的分析

3．2．3 体内发生LTR重组MDV的检测

3．3 结果

3．3．1 MDV LCY-BAC株重组REV LTR

3．3．2 体内发生LTR重组MDV的分析

3．4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

作者简历