带有REV-LTR的MDV重组野毒株生物学特性的研究

摘要

近几年来，经MDV疫苗CVI988/Rispens疫苗免疫后仍有些鸡群显示较高的肿瘤发生率。因此，国内外学者怀疑是否出现了能突破该疫苗保护作用的致病性更强的MDV野毒株。 张志等2001年从广西某个发生肿瘤的鸡群中分离到一株带有REV-LTR的天然MDV野毒株GX0101。为了显示免疫失败是否与该流行株的致病性增强有关，张志(2004)和庄国庆(2006)分别在SPF鸡中做了人工感染试验，表明GX0101对鸡的致病性高于强毒GA。本研究在经HVT免疫的SPF鸡的攻毒试验中，GX0101株的致死率(28.6％)和致肿瘤率(7.1％)均低于超强毒参考株Md5的致死率(63.1％)和致肿瘤率(19.0％)，但是，利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA检测表明，与GX0101攻毒鸡同罩饲养的未经免疫未攻毒的对照鸡，从攻毒后第28d就有6/15的比例从羽毛囊中检出MDV，而与vvMd5接种鸡同一隔离罩的对照鸡，在35d时才在2/14的个体中检出MDV，即GX0101的横向传播能力大于超强毒株。在SPF鸡试验中这一结果表明，MDV的致病性不一定与横向传播力相平行。由此推测，显著增高的横向传播能力可能就是这一整合进REV-LTR的重组病毒株能在鸡群中逐渐流行开来的选择性竞争优势之一。 试验还进一步比较了斑点杂交和琼脂扩散试验在动物实验中的应用，实验结果表明本试验证明斑点杂交试验在攻毒后第10d即可从羽毛囊中检测到病毒，而琼脂扩散试验在攻毒后第14d检测到病毒，斑点杂交的最高检出率为100％，而琼脂扩散试验的最高检出率为80％，斑点杂交的检出率也高于与琼脂扩散试验。斑点杂交的检测灵敏度达1pg DNA水平。可以对大量的样品进行快速，简便，准确的检测，可作为临床MDV检测的有效手段；因此，斑点杂交在实际生产中有很广泛的应用。 为了模仿并跟踪反转录病毒与MDV病毒在鸡体内自然发生的基因重组，用PCR来追踪鸡体内二种病毒发生重组的动态。根据MDV基因组上易插入REV的LTR的高频位点的序列合成7条引物，根据REV的LTR合成4条引物，由此交叉组成28对引物，同样设计ALV-MDV之间30对引物来扩增重组片段，从中分离筛选整合进反转录病毒基因序列的重组MDV。此次试验MDV与REV或ALV人工共感染，在连续传到第17代时，利用PCR还没有扩增检测有重组片段。这说明二种不同病毒在体内发生重组的机率确实非常小。但是能从鸡群中比较容易分离到重组野毒株，GX0101还说明这是经过长期的选择而产生的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

声明

1前言

1.1病原学

1.2流行特点

1.3临床症状

1.4病理变化

1.5鉴别诊断

1.6实验室诊断

1.6.1病毒分离

1.6.2病毒抗原的检测

1.6.3DNA探针技术

1.7病毒的变异

1.7.1MDV变异的重要因素

1.7.2 MDV毒力变异成增强的趋势

1.7.3MDV致病性的改变

1.8 MDV和REV共感染

1.9病毒重组

1.10斑点杂交与琼脂扩散试验的比较

2带有REV-ITR的马立克氏病病毒重组野毒株与超强毒株致病性与横向传播性的比较

2.1材料和方法

2.1.1材料

2.1.2主要试剂和仪器

2.1.3分组

2.1.4组织DNA的提取

2.1.5扩增MDVpp38基因片段

2.1.6斑点杂交反应

2.2试验结果

2.2.1二株MDV诱发海蓝褐鸡的死亡率和肿瘤发生率比较

2.2.2二株MDV诱发SPF鸡的死亡率和肿瘤发生率比较

2.2.3MDV诱发的肿瘤照片

2.2.4MDVpp38核酸探针灵敏度

2.2.5斑点分子杂交检测感染鸡的羽毛囊中的MDV

2.2.6二株MDV病毒横向传染性的比较

2.3讨论

3核酸探针斑点杂交和琼脂扩散试验检测马立克氏病病毒的比较

3.1材料和方法

3.1.1材料

3.1.2主要试剂和仪器

3.1.3分组

3.1.4组织DNA的提取

3.1.5斑点杂交反应

3.1.6琼脂扩散试验

3.2试验结果

3.2.1MDVpp38核酸探针灵敏度

3.2.2斑点分子杂交检测感染鸡的羽毛囊中的MDV

3.2.3琼脂扩散试验检测感染鸡的羽毛囊中的MDV

3.2.4斑点杂交和琼脂扩散试验检测二株MDV病毒的比较

3.3讨论

4马立克氏病病毒与禽网状内皮组织增生病病毒或禽白血病病毒重组病毒的分离

4.1材料与方法

4.1.1MDV、REV、ALV病毒

4.1.2鸡胚成纤维细胞的制作

4.1.3 MDV、REV、ALV单克隆抗体

4.1.4分组

4.1.5病毒的接中和增殖

4.1.6间接荧光抗体试验(IFA)

4.1.7组织DNA的提取

4.1.8利用PCR扩增重组片段

4.2结果

4.2.1MDV、REV、ALV荧光检测结果

4.2.2 PCR扩增结果

4.2.3 MDV诱发的病变

4.3讨论

结论

参考文献

致谢

个人简介