转G2-aroA基因抗草甘膦棉花植株的获得及特异性检测

摘要

棉花是我国重要的经济作物，在国民经济中占据着非常重要的战略地位。棉田杂草丛生，会严重影响棉花的产量和质量。棉田化学除草是棉花生产中降低成本、提高经济效益的根本途径。草甘膦是一种灭生性除草剂，具有广谱、高效、低毒和无残留的优点;但是，其在杀灭田间杂草的同时，也会伤害农作物。利用基因工程技术，培育和推广具有草甘膦抗性的棉花新品种，对于利用草甘膦进行棉田化学除草具有重要意义。目前，国内可用于商业化的抗除草剂棉花尚未见报道。开展具有自主知识产权的抗除革剂转基因棉花的研究，对我国棉花产业具有重大意义。本研究运用农杆菌介导法，将具有自主知识产权的抗草甘膦基因G2-aroA转入珂字棉312中，获得了抗草甘膦转基因棉株，并对其进行了抗性鉴定和分子生物学分析，为该种质的开发利用提供了科学依据。研究结果如下:
　　1.抗草甘膦转基因棉花的获得
　　以珂字棉312下胚轴为外檀体，用卡那霉素作为抗性筛选剂，通过农杆菌介导法，将菊花Rubisco小亚基基因启动子驱动的G2-aroA基因导入了棉花基因组中，获得了10个转化事件(T0)。这些转化事件，都能正常开花结实。卡那霉素、草甘膦筛选试验和PCR检测、Southern Blot等分子生物学分析，均证实G2-aroA基因已成功导入了棉花基因组中。
　　2.转基因棉花后代遗传分析
　　T0代转基因植株自交种子，种成株行(T1)。田间卡那霉素抗性鉴定结果，经x2卡方检验，表明各转化子(T1)均符合单位点插入的3∶1分离规律，与分子生物学检测结果一致。
　　3.转基因棉花草甘膦抗性鉴定
　　对田间性状优异的抗草甘膦转基因棉花BG2-7，用浓度分别为0‰、1‰、2‰、4‰、8‰和10‰的草甘膦溶液，进行喷施鉴定。非转基因棉花对草甘膦非常敏感，2‰草甘膦（大田推荐施用浓度）处理就全部死亡。转基因棉花，2‰草甘膦处理能够正常生长;随草甘膦浓度的增加，转基因棉花的生长受抑制情况逐渐明显;10‰草甘膦（5倍大田推荐浓度）处理仍能缓慢生长，开花结实。草甘膦抗性鉴定结果表明，转基因棉花BG2-7具有较高的草甘膦抗性。
　　4.转基因棉花BG2-7外源插入基因的侧翼序列分析
　　通过TAIL-PCR和普通PCR扩增，获得了转基因棉花BG2-7外源DNA插入片段的侧翼序列。本研究所导入的外源基因，插入到了棉花基因组第十一号染色体上，5'端位于染色体的第61，253，333处;棉花基因组序列与外源基因5'端之间有31 bp的棉花微卫星序列;外源基因Leftboder缺失84 bp碱基，Right boder缺失298 bp碱基，棉花基因缺失30 bp碱基;。
　　5.转基因棉花BG2-7特异性检测方法的建立
　　依据获得的侧翼序列信息，分别设计BG2-7转化事件外源基因5'端和3'端特异性PCR检测引物。经筛选，分别确定引物 GTCATAACGTGACTCCCTTAATTCTCC/CCTATTACACGGCTATGC为特异性PCR5'端检测引物，引物TCCTTTCGCTTTCTTCCCTT/ACACTTACATGGCGTCTTCT为3'端检测引物，建立了BG2-7转化事件的特异性检测方法。5'端的检测灵敏度，可以达到44个拷贝;3'端的检测灵敏度可以达到88个拷贝。
　　另外，还依据侧翼序列信息，设计了复合PCR引物。引物ATGGAAGGGCTGTTGATACA/TCTGACATCATGGATCGCAA扩增棉花基因组序列，引物TCGCTTTCTTCCCTTCCTTT/TCTGACATCATGGATCGCAA扩增3'端特异性序列，分别进行PCR扩增，建立了BG2-7转化事件纯合子的筛选方法。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 我国棉田杂草的研究现状

1．1．1 棉田杂草的发生规律

1．1．2 棉田杂草的防控措施

1．2 除草剂发展与应用

1．2．1 除草剂的发展概况

1．2．2 除草剂分类和特点

1．3 草甘膦除草剂研究现状

1．3．1 草甘膦的作用机制

1．3．2 草甘膦的作用靶标

1．3．3 草甘膦抗性获得的机制

1．4 棉花抗除草剂基因工程发展现状

1．4．1 外源基因的遗传转化方法

1．4．2 我国草甘膦抗性基因的发掘概况

1．4．3 抗除草剂棉花研究进展

1．5 研究的目的意义及研究思路

第二章 转基因抗草甘膦棉花的获得及遗传分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 转基因抗草甘膦棉花的获得

2．2．2 转基因棉花的PCR检测

2．2．3 转基因棉花的卡那霉素筛选

2．2．4 转基因棉花的草甘膦筛选

2．2．5 荧光定量PCR方法检测转基因棉花的拷贝数

2．2．6 转基因棉花的Southern检测

2．2．7 转基因棉花的反转录PCR检测

2．2．8 转基因棉花的Western检测

2．2．9 转基因棉花的遗传学分析

2．2．10 转基因棉花草甘膦耐受性鉴定

2．3 讨论

第三章 转基因棉花外源基因侧翼序列分析及特异性检测方法建立

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料和所需试剂

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 外源插入基因侧翼序列的获得

3．2．2 插入结构特征分析

3．2．3 转基因棉花BG2-7特异性PCR检测方法的建立

3．2．4 转基因棉花BG2-7纯合子筛选方法的建立

3．3 讨论

第四章 全文结论及创新点

参考文献

致谢

作者简历