口蹄疫病毒感染细胞中PI4KB招募以及3A-3Dpol-PI4KB复制复合物的形成

摘要

微RNA病毒(Picornavirus)感染细胞后，破坏细胞内物质的双向运输，细胞内膜被重构成以磷脂酰肌醇-4-磷酸（Phosphatidylinositol-4-phosphate，PI4P）为主的膜环境。在重构的细胞膜结构上，病毒通过其非结构蛋白招募特定细胞蛋白在细胞内膜上形成病毒复制复合物，这是微RNA病毒有效复制的基础。PI4P是由磷脂酰肌醇-4-激酶Ⅲβ亚基(Phosphatidylinositol-4-kinaseⅢβ，PI4KB)催化生成，因此，病毒蛋白招募PI4KB到达复制位点对病毒的复制至关重要。微RNA病毒招募PI4KB的分子机制，是近几年病毒学研究的热点。微RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp，又称3Dpol）的生物学功能是复制病毒的RNA，因此，3Dpol是病毒复制复合物的核心。研究复制复合物的形成是了解病毒在感染细胞中复制过程的重要方面。
　　口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的传染病，给牛羊猪等偶蹄动物养殖业造成巨大的经济损失。FMDV是一种微RNA病毒，其显著特点是复制速度快和宿主嗜性范围广，这可能与病毒独特的复制特性有关。本研究旨在探讨FMDV在感染细胞中招募PI4KB的机制以及病毒复制复合物的形成。
　　在IBRS-2细胞中，特异性沉默内源性PI4KB的表达，可抑制FMDV非结构蛋白3A的表达、降低病毒复制的滴度以及抑制病毒基因组的复制;相反，PI4KB的过表达可促进3A的表达、提升病毒的滴度以及提高病毒基因组的复制。这些结果表明，PI4KB是FMDV复制所必需的细胞蛋白。Co-IP和GST pulldown实验证实，FMDV3A与PI4KB存在间接的相互作用;在FMDV感染细胞中，3A与内源性PI4KB共定位于复制位点，表明FMDV3A间接招募PI4KB到达病毒复制位点，暗示存在其它蛋白介导3A招募PI4KB。进一步的研究发现，FMDV3A和PI4KB都直接相互作用于细胞蛋白酰基辅酶A含3结合域(Acyl-Co-A Binding Domain containing3，ACBD3)的羧基端GOLD结构域;GST pulldown竞争实验证实，3A与ACBD3结合的亲和性高于ACBD3与PI4KB的结合，这些结果表明3A竞争性结合ACBD3-PI4KB中的ACBD3，暗示ACBD3介导3A招募PI4KB。然而，沉默IBRS-2细胞内ACBD3的表达并不损害FMDV3A与PI4KB的共定位以及FMDV的复制，说明ACBD3对于3A招募PI4KB是非必需的。这些结果提示，存在未知的蛋白介导FMDV3A招募PI4KB到达病毒的复制位点。在筛选与FMDV3Dpol相互作用的细胞蛋白过程中，PI4KB被鉴定为与3Dpol相互作用的候选蛋白。Co-IP和GST pulldown证实FMDV3Dpol与PI4KB存在直接相互作用;在FMDV感染细胞过程中，3Dpol与内源性PI4KB共定位于病毒的复制位点;另外，FMDV3Dpol与3A之间也存在相互作用。这些结果表明，在FMDV复制位点可形成至少包含3A、3Dpol和PI4KB的复制复合物，此复合物的形成是FMDV有效复制的前提。
　　概括起来，本研究有三个贡献点:FMDV3A招募PI4KB到达病毒复制位点，后者是病毒复制所必需的;尽管3A竞争性结合ACBD3-PI4KB中的ACBD3，但是ACBD3对于3A招募PI4KB是非必需的;在FMDV感染细胞中3A-3Dpol-PI4KB复制复合物形成于病毒复制位点，这是病毒进入细胞后发生复制的前提条件。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 口蹄疫病毒的分子生物学

1．1．1 口蹄疫病毒与口蹄疫

1．1．2 口蹄疫病毒基因组的结构

1．1．3 口蹄疫病毒编码的结构蛋白

1．1．4 口蹄疫病毒编码的非结构蛋白

1．1．5 口蹄疫病毒基因组的非编码区

1．1．6 蛋白相互作用的研究方法

1．2 微RNA病毒的复制复合物

1．2．1 微RNA病毒的生命周期

1．2．2 微RNA病毒复制复合物的研究

1．2．3 存在的问题和假说

1．3 本研究的目的及意义

第二章 口蹄疫病毒感染细胞中PI4KB招募以及3A-3Dpol-PI4KB复制复合物的形成

2．1 材料和方法

2．1．1 载体、细胞、毒株、生化试剂以及抗体

2．1．2 仪器设备

2．1．3 试剂及溶液的配制

2．1．4 RNA的提取及其反转录

2．1．5 质粒的构建

2．1．6 蛋白在细菌细胞的表达

2．1．7 细胞的转染

2．1．8 病毒接种及细胞处理

2．1．9 病毒TCID50的测定

2．1．10 Western blot检测

2．1．11 GST pulldown

2．1．12 免疫共沉淀

2．1．13 激光共聚焦

2．1．14 Real-time RT-PCR

2．1．15 RNA干扰

2．1．16 数据分析

2．2 结果

2．2．1 沉默PI4KB抑制3A蛋白的表达以及FMDV的复制

2．2．2 过表达PI4KB促进3A蛋白的表达以及FMDV的复制

2．2．3 FMDV 3A间接招募PI4KB到达病毒复制位点

2．2．4 FMDV的复制不依赖于细胞蛋白GBF1

2．2．5 FMDV 3A蛋白与细胞蛋白ACBD3相互作用

2．2．6 ACBD3与细胞蛋白PI4KB共定位

2．2．7 ACBD3的GOLD结构域介导其与FMDV 3A与P14KB的相互作用

2．2．8 FMDV 3A竞争性结合ACBD3

2．2．9 ACBD3对于FMDV 3A招募PI4KB到达病毒复制位点是非必需的

2．2．10 ACBD3不是FMDV复制必需的细胞蛋白

2．2．11 FMDV 3Dpol是PI4KB相互作用蛋白

2．2．12 FMDV 3Dpol与内源性PI4KB共定位于病毒复制位点

2．2．13 在FMDV复合物位点3A-3Dpol-PI4KB复合物的形成

2．3 讨论

第三章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历