‘惠’苹果自交后代叶片离体高效再生体系和遗传转化研究

摘要

为了筛选苹果离体叶片再生效率较高的基因型，为苹果转基因研究提供转化受体新材料，本研究以‘惠’自交F1代和‘华富’ב皇家嘎拉’、‘寒富’ב元帅80-3’、‘元帅80-3’ב寒富’杂交F1代实生苗为试材，采用茎段培养获得试管苗，筛选出增殖能力最强的单株‘惠’自交后代Meg-5，进一步对影响其离体叶片再生不定芽的主要因素进行研究，建立了高效离体叶片再生体系，并在此基础上，初步建立了根癌农杆菌介导的Meg-5遗传转化体系。主要研究内容和结果如下:
　　1.不同杂交组合后代试管苗增殖能力
　　不同杂交后代的试管苗增殖能力筹异明显，‘华富’ב皇家嘎拉’杂交后代试管苗增殖能力较强，其中最强的单株为09-294，增殖系数为3.06;‘寒富’ב元帅80-3’、‘元帅80-3’ב寒富’2个杂交组合后代试管苗增殖能力均较差，增殖系数在1.03～1.56。
　　2.Meg-5试管苗离体叶片高效再生体系
　　研究了激素浓度、暗培养时间、叶片部位、叶片放置方式、试管苗苗龄等对Meg-5试管苗离体叶片再生的影响。结果表明:适宜的再生培养基配方为MS+2.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+2.6 g/L胶立得(Gelzan);最佳暗培养时间为14～21 d;从叶尖部到叶柄部再生效率逐渐升高，叶背向下接种优于叶背向上;最适试管苗苗龄为20～30 d。在此条件下，Meg-5试管苗离体叶片不定芽再生频率可达到100％，单片叶平均再生芽数可达到31.59个。
　　当不定芽长至3 cm以上时，将其转至生根培养基1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.2 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂上，生根率可达100％，平均生根条数7.26条，平均根长3.9 cm。幼苗移栽成活率100％，获得完整植株。
　　3.根癌农杆菌介导的Meg-5遗传转化体系
　　在建立Meg-5试管苗离体叶片高效再生体系的基础上，研究了抗生素浓度、农杆菌菌液浓度、预培养时间、菌液侵染时间、共培养时间、推迟选择时间对其转化效率的影响。结果表明，适宜的Km筛选压为15 mg/L、Cef浓度为200mg/L，菌液浓度OD600值为0.4～0.6，侵染时间为7min，预培养时间为2d，共培养时间为2～3 d，推迟选择时间为2d。在此条件下,Meg-5试管苗离体叶片抗性芽再生率最高为4.17％。
　　随机选择抗性芽进行PCR检测后证明，利用此转化体系可成功获得Meg-5的转基因植株。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 苹果离体叶片再生研究进展

1．1．1 基因型

1．1．2 叶片来源和接种方式

1．1．3 培养基及其添加物

1．1．4 黑暗培养

1．2 苹果遗传转化研究进展

1．2．1 遗传转化方法

1．2．2 菌株类型

1．2．3 抗生素

1．2．4 基因型

1．2．5 菌液浓度和侵染时间

1．2．6 预培养和共培养

1．2．7 推迟选择和选择培养

1．3 本研究的意义和内容

1．3．1 本研究的目的与意义

1．3．2 本研究的技术路线

第二章 材料与方法

2．1 试管苗的培养

2．1．1 试验材料

2．1．2 外植体处理与初代、继代培养

2．2 离体叶片再生体系的建立

2．2．1 试验材料

2．2．2 叶片再生能力比较试验

2．2．3 不同激素浓度叶片再生试验

2．2．4 不同暗培养时间叶片再生试验

2．2．5 叶片不同部位再生试验

2．2．6 叶片不同放置方式再生试验

2．2．7 不同苗龄试管苗叶片再生试验

2．2．8 培养基中添加AgNO3再生试验

2．2．9 再生芽的增殖与生根、移栽试验

2．3 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立

2．3．1 试验材料

2．3．2 菌株和质粒

2．3．3 抗生素敏感性试验

2．3．4 农杆菌菌液的制备

2．3．5 菌液浓度对转化效率的影响试验

2．3．6 预培养时间对转化效率的影响试验

2．3．7 侵染时间对转化效率的影响试验

2．3．8 共培养时间对转化效率的影响试验

2．3．9 推迟选择对转化效率的影响试验

2．3．10 侵染叶片组织化学染色

2．3．11 抗性芽PCR检测

2．4 数据处理与计算方法

第三章 结果与分析

3．1 试管苗的获得

3．1．1 茎段初代培养

3．1．2 无菌苗继代培养

3．2 离体叶片再生体系的建立

3．2．1 叶片再生能力比较

3．2．2 激素浓度对Meg-5叶片再生的影响

3．2．3 暗培养时间对Meg-5叶片再生的影响

3．2．4 叶片部位对Meg-5叶片再生的影响

3．2．5 叶片放置方式对Meg-5叶片再生的影响

3．2．6 苗龄对Meg-5叶片再生的影响

3．2．7 AgNO3对Meg-5叶片再生的影响

3．2．8 Meg-5叶片再生不定芽的增殖、生根与移栽

3．3 遗传转化体系研究

3．3．1 Km对Meg-5叶片再生的影响

3．3．2 Gef对Meg-5叶片再生的影响

3．3．3 菌液浓度对Meg-5转化效率的影响

3．3．4 预培养时间对Meg-5转化效率的影响

3．3．5 侵染时间对Meg-5转化效率的影响

3．3．6 共培养时间对Meg-5转化效率的影响

3．3．7 推迟选择时间对Meg-5转化效率的影响

3．3．8 侵染叶片组织的化学染色

3．3．9 抗性芽PCR检测

第四章 讨论

4．1 影响苹果离体叶片再生的内在因素

4．1．1 基因型对苹果离体叶片再生的影响

4．1．2 外植体生理状态对苹果离体叶片再生的影响

4．2 影响苹果离体叶片再生的外在因素

4．2．1 激素的种类与浓度对苹果离体叶片再生的影响

4．2．2 暗培养对苹果离体叶片再生的影响

4．3 影响苹果转化效率的主要因素

第五章 结论

5．1 无菌苗增殖体系研究

5．2 离体叶片高效再生体系研究

5．3 农杆菌介导的遗传转化体系研究

参考文献

致谢

作者简历