温度诱导烟粉虱DNA甲基化的特征和Dnmt1基因温度耐受性功能的鉴定

摘要

烟粉虱MED隐种自入侵我国以来，迅速扩散至我国大部分地区，其在短时间内对不同地理环境的成功适应显示了其极强的生态适应性。本研究着眼于烟粉虱入侵的生态适应性机制，从温度耐受性差异的生态学现象出发，从表观遗传学的角度，研究不同温度胁迫处理下，烟粉虱入侵种MED隐种和本地种AsiaII3隐种各世代之间及雌雄之间的耐受性差异;在此基础上采用F-MSAP技术，探讨甲基化变化与温度耐受性变化的关系;最后通过RACE技术克隆烟粉虱3个隐种的BtDnmt1基因，并采用RNAi技术对该基因的温度耐受性功能进行了验证。主要结果与结论如下:
　　1.烟粉虱温度胁迫耐受性具有可遗传性:
　　(1)温度胁迫耐受性至少可以遗传1-3代;高温对烟粉虱耐受性的影响大于低温对耐受性的影响;耐热性的改变幅度高于耐寒性的改变幅度;雌虫的温度耐受性的遗传力高于雄虫温度耐受性的遗传性;
　　(2) MED隐种对高温胁迫耐受性改变幅度高于本地AsiaII3隐种:其中MED隐种的亲一代(F1)的耐热性和子一代(F11)的耐寒性显著高于AsiaII3隐种。
　　(3)不同产卵温度胁迫对烟粉虱耐受性影响显著:连续性温度胁迫诱导的MED隐种耐受性的改变幅度均显著高于非连续性的;且连续性胁迫诱导的MED隐种耐受性的改变在子代中具有更高的遗传力。
　　2.烟粉虱温度胁迫的耐受性与DNA甲基化变化密切相关:
　　(1)MED隐种不同温度胁迫处理组的不同世代的甲基化水平均低于AsiaII3隐种，但MED隐种总甲基化率均高于其对照组;AsiaII3隐种甲基化水平均却低于其对照组;
　　(2)MED隐种和AsiaII3隐种不同发育历期的DNA甲基化水平和模式有差异;
　　(3)温度胁迫下，卵期DNA甲基化水平显著高于其它发育阶段。连续性温度胁迫卵的甲基化率升高幅度大于非连续性温度胁迫。
　　3.克隆得到了烟粉虱MED、MEAM1和AsiaII3三个隐种Dnmt1基因的全长cDNA序列:其推导氨基酸序列均具有Dnmt1蛋白的典型结构，即N端调控区的复制叉作用位点(Dnmt1-RFD)、锌指结构域(zf-CXXC)、两个BAH结构域及C端催化活性结构域Dcm。RNAi结果发现该基因表达量显著降低能显著影响烟粉虱响应温度胁迫的存活率，表明Dnmtl对烟粉虱温度耐受性起关键作用。
　　综上所述，烟粉虱的耐受性改变可以遗传，且烟粉虱的耐受性变化与DNA甲基化变化密切相关，其中Dnmt1在烟粉虱的温度耐受性中起关键作用。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 引言

1．1 DNA甲基化概述

1．1．1 表观遗传学

1．1．2 DNA甲基化的生物学意义

1．1．3 DNA甲基转移酶的分类

1．1．4 DNA甲基化检测方法

1．2 昆虫温度胁迫适应性的研究进展

1．2．1 昆虫温度耐受性的评价方法

1．2．2 昆虫对温度胁迫的响应

1．3 本研究的立题依据和主要内容

1．3．1 立题依据

1．3．2 研究内容

1．3．3 技术路线

第二章 烟粉虱温度胁迫耐受性的可遗传性

2．1 实验材料

2．1．1 供试昆虫及寄主植物

2．1．2 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 连续性温度胁迫处理

2．2．2 非连续性温度胁迫处理

2．2．3 数据处理方法

2．3 结果与分析

2．3．1 连续性高温度胁迫处理MED隐种耐受性差异比较

2．3．2 连续性温度胁迫处理AsiaII3隐种耐受性差异比较

2．3．3 连续性温度胁迫处理MED隐种与AsiaII3隐种耐受性比较

2．3．4 非连续性温度胁迫MED隐种耐受性差异比较

2．3．5 连续性与非连续性温度胁迫处理MED隐种耐受性差异比较

2．4 小结与讨论

第三章 温度诱导烟粉虱DNA甲基化筛选分析

3．1 实验材料

3．1．1 供试昆虫及寄主植物

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器及设备

3．2 实验方法

3．2．1 样本的采集

3．2．2 全基因组DNA制备

3．2．3 引物筛选与设计

3．2．4 酶切与连接

3．2．5 预扩增与选择性扩增

3．2．6 DNA甲基化的检测

3．3 结果与分析

3．3．1 全基因组DNA的提取

3．3．2 DNA甲基化模式及引物的筛选

3．3．3 MED隐种不同温度处理不同世代DNA甲基化水平和模式分析

3．3．4 AsiaII3隐种不同温度处理不同世代DNA甲基化水平和模式分析

3．3．5 MED隐种和AsiaII3隐种不同龄期的DNA甲基化水平和模式分析

3．3．6 MED隐种不同产卵温度的卵的DNA甲基化水平和模式分析

3．4 小结与讨论

第四章 烟粉虱Dnmt1基因克隆及功能验证

4．1 试验材料

4．1．1 供试昆虫

4．1．2 实验试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 主要试剂配制

4．2 实验方法

4．2．1 MED、MEAM1和AsiaII3隐种Dnmt1基因全长cDNA克隆与分析

4．2．2 MED、MEAM1和AsiaII3隐种Dnmt1基因的功能验证

4．3 结果与分析

4．3．1 MED、MEAM1和AsiaII3隐种Dnmt1基因序列及结构分析

4．3．2 烟粉虱Dnmt1基因的系统发育分析

4．3．3 烟粉虱Dnmt1基因的功能验证

4．4 小结与讨论

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．1．1 烟粉虱温度胁迫耐受性的可遗传性

5．1．2 温度诱导烟粉虱DNA甲基化筛选分析

5．1．3 烟粉虱Dnmt1基因克隆及功能验证

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

致谢

作者简历