Bt cry1Ia8/cry1C基因转化甘蓝及高代转基因甘蓝的抗虫性研究

摘要

结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata）是我国一种重要的蔬菜。目前，生产上为害甘蓝生长的主要是菜青虫、小菜蛾、甘蓝夜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫。甘蓝类蔬菜中抗虫种质资源缺乏，因此利用传统育种方法培育抗虫品种比较困难。通过基因工程将外源抗虫基因整合到植物基因组中，可为甘蓝抗虫育种提供有效的种质资源。
　　cry1Ia8基因是由中国农业科学院植物保护研究所分离克隆获得的，其编码的毒蛋白对小菜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力，与生产上常用的Cry1Ac抗虫蛋白没有交互抗性。cry1C基因是经中国农业科学院植物保护研究所进行密码子优化后由本课题组人工合成的基因，对鳞翅目夜蛾类害虫有显著的抗虫效果。本研究构建了cry1Ia8-cry1C双价表达载体，利用根癌农杆菌介导法将双价基因导入结球甘蓝，以期获得两种毒蛋白同时表达的转基因植株，既可有效抑制小菜蛾、菜青虫等害虫，又可降低夜蛾类害虫对甘蓝的危害。同时对转cry1Ia8基因甘蓝和转cry1Ia8-cry1Ba3基因甘蓝后代的农艺性状、抗虫性及对意大利蜜蜂的影响进行了调查。主要研究结果如下：
　　1.构建cry1Ia8-cry1C双价表达载体，通过PCR检测和序列测定，证明外源基因cry1Ia8和cry1C已经整合到同一植物表达载体上。
　　2.对以F13J85为转化受体的甘蓝再生体系和转化体系进行了优化，以下胚轴和具柄子叶为外植体，苗龄5 d，平放培养基上接种时，外植体不定芽再生率最高；农杆菌侵染时将OD600为0.6-0.8的菌液稀释至0.1-0.2，侵染12-15 min，转化效率最高，后期农杆菌污染较少。将cry1Ia8-cry1C双价基因导入甘蓝获得16株卡那霉素抗性植株，对转化植株进行PCR检测，有12株扩增出目的片段；southern检测，有8株阳性植株；RT-PCR和Western blot检测，均有7株阳性植株。
　　3.2014年秋，调查田间转cry1Ia8基因甘蓝和转cry1Ia8-cry1Ba3基因甘蓝T4代纯系的农艺性状及害虫种类和数量，转基因植株在株高、开展度、单球重、球径、中心柱、最大叶外长和外叶数等主要农艺性状方面，与对照相比均没有显著差异。田间抗虫性试验表明，转cry1Ia8基因甘蓝和转cry1Ia8-cry1Ba3基因甘蓝T4代植株对菜青虫和小菜蛾仍有显著抗性，但对甘蓝夜蛾和甜菜夜蛾的抗虫效果不明显。
　　4.以转cry1Ia8基因甘蓝花粉为材料，饲喂意大利蜜蜂，对其存活率和体重没有显著影响，虽然引起了蜜蜂体内某些代谢解毒酶和蛋白酶活性变化，但不足以对蜜蜂的生长产生不良影响，初步证明转cry1Ia8基因甘蓝花粉对意大利蜜蜂是安全的。