甜菜抗线虫基因Hs1-2鉴定及禾谷孢囊线虫RNAi致死基因功能分析

摘要

甜菜(Beta vulgaris L.)是重要糖料作物，世界范围内约四分之一糖料来源于甜菜。甜菜孢囊线虫(BCN，Heterodera Schachtii Schmidt)是甜菜生产上的重要病害，造成的产量损失达25-50％。抗性育种是甜菜孢囊线虫防控的主要方式。最有效的甜菜抗病资源为野生甜菜Patellifoliaprocumbens，甜菜抗病易位系TR363和TR520带有来自其1号染色体的易位片段也具有甜菜孢囊线虫抗病性。但是只有TR520带有之前克隆的抗病基因Hs1prol，并且Hs1prol只有部分抗病性，因此在两个易位系的共有区域内一定存在第二个抗病基因，命名为Hs1-2。
　　通过γ-射线照射TR520，将易位片段打断，从中筛选获得两个感病易位系TR320及TR659。Hs1-2位点应位于两个抗病易位系TR363和TR520易位片段的共有区域，而不存在于感病易位系TR320及TR659携带的易位片段上。
　　本研究的主要目的是通过第二代测序技术对TR520、TR363及TR659进行全基因组测序，从而找到Hs1-2位点。共获得了1，822，146，316读长序列，经过扣除法的生物信息分析，去掉属于感病品种的序列，最终将Hs1-2位点定位到375kbp范围内。来自TR520的RNA-seq数据映射到这一区域，从中筛选了10个基因进行下一步分析。
　　以TR520植株在线虫侵染后3、7、15及25天的根组织为材料，应用RT-qPCR检测筛选的10个基因的表达量变化，结果表明ORF901、ORF903、ORF906及ORF910的表达量在线虫侵染后7dpi及15dpi显著下降。ORF902含有2个钙离子结合结构域，与钙调磷酸酶B类基因(CBL)高度同源，在线虫侵染后7dpi上升表达。ORF904与MAP3K蛋白激酶基因具有较高相似度，并且在线虫侵染后3dpi上升表达，因此，ORF902及ORF904筛选为Hs1-2位点的抗病候选基因，可能参与线虫抗病性的早期反应。ORF905类似于亮氨酸拉链转录因子(bZIP)，bZIP类转录因子在水杨酸信号传导中发挥作用，能够增加作物的抗逆性，并且ORF905在线虫侵染后的3dpi、7dpi及15dpi均上升表达。ORF908类似于一个F-box蛋白，在线虫侵染后的3dpi、7dpi、15dpi及25dpi均上升表达。因此ORF905及ORF908也筛选为Hs1-2位点的抗病候选基因。通过甜菜发根体系，应用RNAi方法对ORF902及ORF904的功能进行了分析，结果当靶标基因沉默后，植物的抗病表型并没有改变，表明ORF902及ORF904没有参与Hs1-2位点介导的线虫抗病性。最终筛选ORF905及ORF908为Hs1-2位点的抗病候选基因，基因功能验证需要进一步分析。
　　应用体外RNAi技术，结果表明2个far基因及2个致死候选基因dsRNA处理后，禾谷孢囊线虫的侵染率，与对照针对eGFP的dsRNA处理相比明显下降。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 甜菜基本特征与分布范围

1．2 甜菜染色体与基因组研究

1．2．1 甜菜遗传图谱分析

1．2．2 甜菜孢囊线虫抗病易位系

1．2．3 甜菜基因组及转录组研究

1．3 甜菜孢囊线虫

1．3．1 甜菜孢囊线虫的致病型与寄主范围

1．3．2 甜菜孢囊线虫形态特征及生活史

1．3．3 甜菜孢囊线虫的危害与防控

1．4 植物与线虫互作研究进展

1．4．1 植物对线虫的免疫反应

1．4．2 线虫抗病基因

1．4．3 植物激素在植物线虫互作中的作用

1．4．4 线虫调控及抑制植物免疫反应

1．4．5 非编码small RNA在线虫与宿主互作中的作用

1．5 植物发根体系在抗病基因功能验证中的应用

1．6 本研究的目的和意义

1．6．1 本研究的目的

1．6．2 本研究的意义

第二章 甜菜孢囊线虫抗病基因Hs1-2位点的定位分析与基因预测

2．1 材料与方法

2．1．1 供试植物材料

2．1．2 供试线虫材料

2．1．3 主要试剂仪器和耗材

2．1．4 DNA提取方法

2．1．5 易位系的分子标记分析

2．1．6 全基因组测序

2．1．7 RNA提取及测序

2．1．8 测序数据纯化与处理

2．1．9 Hs1-2位点基因的预测与功能注释

2．1．10 凰7r誓位点基因0RF全长克隆及基因结构分析

2．2 结果与分析

2．2．1 易位系分子标记分析

2．2．2 测序结果分析

2．2．3 Hs1-2位点物理图谱分析

2．2．4 易位片段的结构分析

2．2．5 Hs1-2位点BCN抗病候选基因筛选

2．2．6 Hs1-2位点基因ORF全长克隆及基因结构分析

2．3 小结与讨论

第三章 Hs1-2位点基因的表达分析

3．1 材料与方法

3．1．1 供试植物材料

3．1．2 供试线虫材料

3．1．3 主要试剂与耗材

3．1．4 主要仪器

3．1．5 RNA提取及cDNA合成

3．1．6 应用RT-PCR在抗感株系中对预测基因进行表达分析

3．1．7 应用RT-qPCR进行线虫接种前后基因表达差异分析

3．2 结果与分析

3．2．1 应用RT-PCR在抗感株系中对预测基因进行表达分析

3．2．2 应用RT-qPCR进行线虫接种前后基因表达差异分析

3．3 小结与讨论

第四章 利用甜菜发根体系通过RNAi验证Hs1-2候选基因功能

4．1 试验材料和方法

4．1．1 供试植物材料

4．1．2 供试线虫材料

4．1．3 主要试剂和耗材

4．1．4 主要仪器

4．1．5 DNA提取方法易位系的分子标记分析

4．1．6 RNA的提取及cDNA的合成

4．1．7 载体构建

4．1．8 将双元载体转入发根农杆菌中

4．1．9 发根转化与阳性克隆的筛选

4．1．10 线虫抗性鉴定

4．2 结果与分析

4．2．1 RNAi载体的构建

4．2．2 发根转化

4．2．3 卡那霉素抗性筛选

4．2．4 DsRed荧光筛选分析

4．2．6 发根的POR检测结果

4．2．7 转基因的发根中靶基因的表达分析

4．2．6 线虫接种实验

4．3 小结与讨论

第五章 禾谷孢囊线虫FAR基因及致死候选基因功能验证

5．1 试验材料和方法

5．1．1 供试植物材料

5．1．2 供试线虫材料

5．1．3 主要试剂和耗材

5．1．4 主要仪器

5．1．5 总RNA的提取和cDNA第一链的合成

5．1．6 DsRNA干扰片段的合成

5．1．7 DsRNA浸泡小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫

5．1．8 定量RT-qPCR检测Ha-far-1，Ha-far-2的发育表达及dsRNA处理后基因的转录丰度

5．1．9 接种实验

5．1．10 小麦根组织内线虫染色

5．1．11 Ha-far-1，Ha-far-2的进化树分析

5．2 结果与分析

5．2．1 DsRNA的合成效果

5．2．2 二龄幼虫吞咽效果

5．2．3 DsRNA处理后肠Ha-far-1，Ha-far-2及致死候选基因的转录丰度检测

5．2．4 禾谷孢囊线虫Ha-far-1、Ha-far-2 基因的发育表达结果

5．2．5 活体外介导的RNA i处理对线虫侵染能力的影响

5．2．6 活体外介导的RNAi对线虫发育的影响

5．2．7 线虫FAR蛋白的进化树分析

5．3 小结与讨论

第六章 全文总结

参考文献

附录

致谢

作者简介