大豆孢囊线虫33E05、34B08和Hg-exP-1基因RNAi功能初步分析与甜菜孢囊线虫分子检测研究

摘要

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)病是大豆上毁灭性的病害，该病害分布范围大、寄主范围广、传播途径多，造成的经济损失严重，是一种公认的极难防治的大豆病害。目前对于大豆孢囊线虫病主要以化学防治为主，通过研究大豆孢囊线虫取食管相关基因，明确大豆孢囊线虫取食管的形成机理和作用机制，可以为开发新型防控技术提供重要的理论基础。本研究以大豆孢囊线虫33E05基因为研究对象，采用发育表达分析，亚细胞定位技术和体外RNAi等研究该基因的表达特性与功能。
　　亚细胞定位结果表明，大豆孢囊线虫取食管形成相关基因33E05，34B08表达蛋白定位于寄主植物细胞膜，原生质体的定位实验确定了其定位在细胞膜而非细胞壁。推测大豆孢囊线虫分泌的效应蛋白33E05，34B08可能通过作用于细胞膜与内质网等，参与了线虫取食管的形成与维持。对33E05，34B08的不同龄期的发育表达分析表明，在大豆孢囊线虫的整个发育过程中33E05，34B08基因均有表达，其中在侵染前2龄幼虫(J2)与侵染后2龄幼虫(PJ2)中表达量最高，推测这两个基因在大豆孢囊线虫取食管的形成过程中可能起着重要作用。
　　采用体外RNAi技术对大豆孢囊线虫33E05，34B08基因进行了初步的功能研究，实验结果表明经dsRNA浸泡处理后的2龄幼虫靶基因转录水平明显下降。在大豆接种实验中，寄主根内线虫数量与对照无明显差异，由此推测该基因家族可能与线虫发育相关，对线虫侵染能力没有影响。在实验室前期研究的基础上，对大豆孢囊线虫扩展蛋白基因hg-exp-1进行了功能分析。Hg-exp-1体外RNA干扰后，根内2龄幼虫数和雌虫数分别下降38.3％和43.4％。由此确认其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起着重要作用。
　　甜菜孢囊线虫（Heteradera schachtii）是甜菜生产的重要病原物，也是我国重要的进境检疫性线虫病原，为了能够对甜菜孢囊线虫进行快速的分子水平上的检测鉴定，本实验通过对甜菜孢囊线虫的样品进行DNA提取，以RAPD引物进行PCR扩增测序，设计出针对甜菜孢囊线虫的SCAR特异性引物，能够快速灵敏的对甜菜孢囊线虫进行分子水平上的检测鉴定，最低检出阈值为1/40000个孢囊，1/320头2龄幼虫，有利于我国植物检疫工作的快速有效进行，同时也有利于我国线虫病害的防治。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 孢囊线虫简介

1．2 大豆孢囊线虫

1．2．1 大豆孢囊线虫的发生与分布

1．2．2 大豆孢囊线虫生物学特性

1．3 植物寄生线虫效应蛋白研究进展

1．3．1 植物线虫效应蛋白与寄主互作研究进展

1．3．2 植物寄生线虫取食管研究进展

1．4 甜菜孢囊线虫的危害

1．5 植物线虫快速检测技术研究进展

1．5．1 植物线虫以PCR为基础的快速检测技术

1．5．2 甜菜孢囊线虫快速检测技术研究进展

1．5 本研究目的与意义

第二章 大豆孢囊线虫33E05、34B08基因的克隆与分析

2．1 材料和方法

2．1．5 33E05，34B08基因cDNA全长克隆

2．1．6 33E05，34B08基因序列分析

2．1．7 甜菜孢囊线虫同源基因克隆

2．2 结果与分析

2．2．3 甜菜孢囊线虫33E05，34B08同源基因克隆

2．3 小结与讨论

第三章 大豆孢囊线虫33E05、34B08基因表达特性分析

3．1 材料和方法

3．1．4 亚细胞定位

3．1．5 原生质体定位

3．1．6 发育表达分析

3．2 结果与分析

3．2．2 33E05，34B08原生质体定位

3．2．3 33E05，34B08发育表达分析

3．3 小结与讨论

第四章 大豆孢囊线虫33E05，34B08基因体外RNAi功能研究

4．1 材料和方法

4．1．3 33E05、34B08 dsRNA干扰片段的合成

4．1．4 体外RNAi

4．1．5 qRT-PCR检测基因转录丰度

4．1．6 接种实验

4．1．7 根组织内线虫染色

4．2 结果与分析

4．2．1 dsRNA合成

3．2．4 大豆孢囊线虫Hg-exp-1基因RNA干扰功能研究

3．3 小结与讨论

第五章 甜菜孢囊线虫SCAR引物设计

5．1 材料和方法

5．1．1 供试线虫

5．1．2 实验用相关试剂与酶类

5．1．4 甜菜孢囊线虫RAPD引物扩增，测序

5．1．5 甜菜孢囊线虫线粒体DNA扩增，测序

5．1．6 甜菜孢囊线虫SCAR引物设计，测试

5．1．7 甜菜孢囊线虫SCAR引物灵敏度测试

5．2 结果与分析

5．2．1 甜菜孢囊线虫DNA提取、鉴定

5．2．2 甜菜孢囊线虫RAPD引物扩增

5．2．3 甜菜孢囊线虫基于MtDNA特异性引物测试

5．2．4 甜菜孢囊线虫SCAR引物测试

4．3 小结与讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历