黄藤素对LPS诱导的子宫内膜上皮细胞炎症反应的抗炎作用及机制研究

摘要

子宫内膜炎是机体无法自行清除入侵子宫内膜的病原菌进而导致的炎症反应，对当今奶牛等经济动物养殖业的发展有重大危害。目前抗生素、微生态制剂和中草药等被广泛用于治疗子宫内膜炎等子宫相关性疾病。近些年，中草药对子宫内膜炎等疾病的临床治疗成为了研究热点，主要是因为其不仅能够促进血液循环，促进子宫收缩，提升机体抗病能力，还能够抗菌消炎，而且残留少、毒副作用弱。黄藤素作为一种天然的植物药，具有抗菌、消炎、抗病毒和调节免疫应答等多种药理作用。临床上，黄藤素被广泛用于治疗人的慢性子宫内膜炎、妇科炎症、盆腔炎、胃肠炎、骨膜炎等疾病，但其在兽医临床中的应用研究却很少，应用其治疗奶牛等经济动物的子宫内膜炎疾病的报道更少。为了研究黄藤素对子宫内膜炎的抗炎作用及其可能的抗炎机制，开展了以下实验。
　　1.黄藤素对gEECs毒性作用的检测
　　黄藤素作用于山羊子宫内膜上皮细胞(gEECs)后，通过MTT法检测细胞的增殖情况;瑞氏-姬姆萨染色法观察细胞的形态学变化，并通过测定乳酸脱氢酶(LDH)的含量检测胞膜的结构完整性。结果显示，黄藤素对山羊子宫内膜上皮细胞的安全剂量为≤250μg/mL，该剂量范围内药物对细胞活力和细胞形态结构无显著性影响;大于该剂量的黄藤素可显著性提高子宫内膜上皮细胞的膜通透性，对细胞产生毒性作用。黄藤素的浓度在0-100μg/mL时，促进细胞的增殖，而且增殖状态良好，因此选择低、中、高浓度分别为20、40和80μg/mL的黄藤素用于后续的实验研究。
　　2.黄藤素对LPS诱导的gEECs炎症反应中相关细胞因子的影响
　　利用5μg/mL的LPS作用于gEECs12 h建立炎症模型，然后用20，40和80μg/mL浓度的黄藤素对炎症模型治疗4、8、12、24、36h，分别收集正常细胞组、LPS炎症模型组和药物处理组的细胞上清液，ELISA实验法测定各组细胞因子的含量，化学法检测NO的含量。结果显示，相比于对照组LPS诱导的炎症反应中各细胞因子的分泌量显著增多(P＜0.05)。黄藤素一方面可以上调抗炎因子IL-10的分泌，另一方面又可以下调促炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6和炎性介质NO的分泌量，调控炎症反应发生的强弱。而且，黄藤素还可以抑制MMP-2和MMP-9的分泌。说明，黄藤素不仅对LPS诱导的山羊子宫内膜细胞建立的炎症模型具有抗炎作用，还可以对子宫内膜上皮细胞结构的完整性起到保护作用。
　　3.黄藤素对LPS诱导的gEECs炎症模型中TLR4信号通路的影响
　　利用5μg/mL的LPS作用于gEECs12 h建立炎症模型，浓度分别为20，40和80μg/mL的黄藤素对炎症模型治疗8h，然后用RT-PCR法对TLR4信号通路上各蛋白的基因水平进行了测定。结果显示，LPS炎症模型组中IL-1β、TLR4、CD14、TRIF和NF-κBp65mRNA的表达量均显著高于对照组（P＜0.05），而且黄藤素能显著抑制这些蛋白mRNA的表达水平，而MyD88的基因表达量没有任何变化(P＞0.05）。WB检测结果显示，黄藤素作用下，炎性细胞中NF-κBp65的蛋白表达水平显著下降。由此得出，黄藤素的抗炎作用机制可能是通过抑制依赖TRIF的TLR4/CD14和NF-κBp65信号通路。
　　综上所述，黄藤素能够很好的抑制LPS诱导的山羊子宫内膜细胞产生的炎症反应，对炎性细胞因子的分泌具有一定的调节作用，以期为以后临床上应用黄藤素治疗奶牛等经济动物的子宫内膜炎提供一定的实验数据。黄藤素的抗炎作用机制可能是通过抑制依赖TRIF的TLR4/ CD14和NF-κBp65信号通路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 前言

1．1 黄藤素的研究进展

1．1．1 黄藤素的药理作用

1．1．2 黄藤素制剂的研究进展

1．2 奶牛子宫内膜炎的研究进展

1．2．1 奶牛子宫内膜炎分离得到的主要病原菌

1．2．2 TLR4信号通路对子宫内膜炎的免疫调节的重要性

1．2．3 中草药在奶牛子宫内膜炎疾病中的应用

1．3 研究目的及意义

第二章 黄藤素对体外gEECs细胞增殖的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 试验结果

2．2．2 黄藤素对gEECs增殖状态的影响

2．2．3 黄藤素对gEECs的细胞核形态影响

2．2．4 黄藤素对gEECs细胞膜完整性的影响

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 黄藤素对LPs诱导gEECs建立的炎症模型中细胞因子的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 试验结果

3．2．1 黄藤素作用LPS诱导gEECs建立的炎症模型8h后细胞因子的变化

3．2．2 黄藤素作用LPS诱导gEECs建立的炎症模型不同时间后细胞因子的变化

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 黄藤素对LPS诱导gEECs建立的炎症模型中TLR4信号通路的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 试验结果

4．2．2 黄藤素对LPS诱导gEECs建立的炎症模型中NF-κBp65表达的影响

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历