大豆MADS-box家族基因GmNMH7在根发育和结瘤过程中的功能研究

摘要

大豆是重要的粮食作物和油料作物，同时也是具有根瘤固氮能力的作物。GmNMH7为大豆MADS-box家族转录因子，有研究表明该转录因子的编码基因可能与大豆根发育及结瘤有关，但其功能缺乏具体研究。本研究期望通过对该基因的系统探究，为确定该基因在根发育及结瘤调控过程中的作用提供分子基础。从亚细胞定位、基因表达测定、功能鉴定及初步的机理解析等不同层面进行研究，取得主要研究结果如下:
　　1.成功克隆了GmNMH7基因CDS序列，该序列全长684 bp;亚细胞定位结果显示，GmNMH7蛋白在细胞膜和细胞核中均有表达。
　　2.Real-time PCR实验结果表明，对自贡冬豆出苗后进行28 d12 h光照/12 h黑暗的短日处理后，GmNMH7基因在根和根瘤中的表达量明显高于茎、叶、花等其它器官。对2周苗龄的自贡冬豆根瘤菌接种10d内GmNMH7基因的表达模式的分析，显示其与已知的根瘤早期发育相关基因GmENOD40-1、GmENOD40-2、GmNFR5α等的表达模式相似，并且表达高峰早于该类基因。
　　3.在发根转化系统中过表达GmNMH7基因显著降低根瘤数目及根长;在阳性发根中，过表达GmNMH7基因能极显著的降低GmENOD40-1、GmENOD40-2、GmNFR5α的表达量。
　　4.GmNMH7基因启动子（GmNMH7pro）序列生物信息学分析结果表明，其含有大量与根瘤发育及激素应答相关的顺式作用元件。成功构建工程菌株K599∷pC13P1-GmNMH7pro∷GUS，并利用该菌株诱导产生含pC13P1-GmNMH7pro∷GUS载体的转基因发根。GUS染色结果显示在根瘤菌接种之前，GmNMH7pro∷GUS表现为维管束特异性表达。在接种根瘤菌10 d后GmNMH7pro∷GUS则在根瘤中大量表达，说明根瘤菌的诱导使GmNMH7pro失去了维管束表达的特异性;接种根瘤菌28 d后GmNMH7pro∷GUS的表达在根瘤和维管束中难以观察到，说明GmNMH7pro∷GUS在成熟的根瘤中表达很弱。
　　5.本研究证明GmNMH7基因与ABA及GA3之间存在交互调控作用。自贡冬豆幼苗根部GmNMH7基因表达对ABA及GA3处理均有响应。过表达GmNMH7基因降低了阳性发根内ABA的含量，提高了GA3的含量。转基因拟南芥对GA3的响应较ABA更为明显。因此得出结论，GmNMH7基因参与结瘤过程中的结瘤因子信号传导途径并且在结瘤过程中负向调控结瘤数目，该调控过程可能是通过调节GA3含量实现。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 研究背景及意义

1．2 国内外研究进展

1．2．1 豆科植物的结瘤与固氮

1．2．2 MADS-box家族的研究进展

1．3 研究目的意义及技术路线

第二章 大豆GmNMH7基因的克隆及GmNMH7-GFP蛋白亚细胞定位

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 RNA提取及GmNMH7基因克隆

2．2．2 GmNMH7与MsNMH7、AtAP3蛋白序列的一致性

2．2．3 pLB-GmNMH7载体构建

2．2．4 GmNMH7蛋白的亚细胞特异性表达

2．3 讨论

第三章 GmNMH7基因及其启动子表达模式分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 大豆不同组织总RNA提取及cDNA文库构建

3．2．2 GmNMH7基因在在大豆不同组织中的表达

3．2．3 根瘤菌对GmNMH7基因表达的诱导作用

3．2．4 pC13P1-GmNMH7pro∷GUS载体构建

3．2．5 GmNMH7pro生物信息学分析

3．2．6 GmNMH7pro在根瘤发育早期的表达

3．3 讨论

第四章 GmNMH7对根瘤数目及根长的调控

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 pGFPGUS-GmNMH7载体构建

4．2．2 过表达GmNMH7基因对大豆根瘤数目及主根长度的影响

4．2．3 过表达GmNMH7基因对NF信号传导途径早期结瘤基因表达的影响

4．2．4 过表达GmNMH7基因对拟南芥根长的影响

4．2．5 GmNMH7基因调控根瘤和根发育过程中与GA3的交互作用

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历