日本血吸虫凋亡抑制因子及其互作分子的功能研究

摘要

血吸虫病是由血吸虫尾蚴感染人和家畜等哺乳动物而引起的一种严重危害公共卫生健康的人兽共患疾病。由于血吸虫复杂的生活史及其在终末宿主体内免疫系统逃避机制不清，目前仍没有有效的抗血吸虫病疫苗，其治疗主要依赖于化学药物——吡喹酮。细胞凋亡是一种细胞的程序性死亡，在维持体内组织稳态，机体代谢和宿主感染病原体的免疫应答中扮演着重要角色。我们实验室的前期研究中发现血吸虫凋亡抑制因子（Inhibitor of apopotosis protein of Schistosomajaponicum，SjIAP）在日本血吸虫的细胞凋亡调控中可能发挥着重要作用，为深入揭示SjIAP的功能，并为血吸虫病防治药物新靶标的发现及深入阐述日本血吸虫与宿主相互作用分子机理，本论文针对SjIAP，开展以下三个方面研究:
　　1、日本血吸虫凋亡抑制因子RNA干扰研究
　　通过实验室的前期研究，我们获得了干扰SjIAP最佳siRNA分子，通过人工合成干扰小RNA分子，利用电转的方法将其转到日本血吸虫成虫中进行SjIAP干扰研究，应用实时定量PCR方法和蛋白质免疫印迹分别在转录水平和蛋白质水平对干扰效果进行评估。同时，并应用扫描电镜观察干扰后日本血吸虫的体被变化，测定干扰后虫体Caspase3/7活性和干扰后日本血吸虫的活性。结果表明SjIAP干扰后，SjIAP在转录和蛋白质水平均呈现下调表达，干扰组与对照组相比虫体活性降低，死亡数量增加，扫描电镜观察发现干扰SjIAP后虫体体被发生严重的破损，且干扰后虫体Caspase3/7的活性升高，提示干扰SjIAP后，虫体细胞凋亡有所增强。
　　2、日本血吸虫调亡抑制因子互作分子最佳干扰siRNA分子的筛选
　　根据酵母双杂交筛选SjIAP互作分子的实验结果选取了SjIAP互作分子14-3-3家族，Teg20和Ubiquitin C。根据其各自cDNA序列设计siRNA干扰分子，人工化学合成并电转到日本血吸虫成虫体内，利用实时定量PCR方法及测定Caspase3/7的活性筛选出最佳siRNA干扰分子。结果表明siRNA干扰后每个处理组的靶基因在转录水平上均呈现不同程度变化，且Caspase3/7活性也呈现不同程度的升高，综合分析靶基因在转录水平和Caspase3/7活性的变化，获得了各自靶基因的最佳siRNA干扰分子。
　　3、SjIAP互作分子14-3-3，Teg20和Ubiquitin C的功能初步分析
　　根据获得的14-3-3，Teg20和Ubiquitin C的最佳siRNA干扰分子，利用电转方法对这三个互作分子进行干扰，应用Western blot进一步确认干扰后蛋白水平上的变化，同时利用扫描电镜观察日本血吸虫体被的变化，并测定干扰后的日本血吸虫活性和死亡数量。结果表明获得的最佳siRNA分子干扰SjIAP互作分子14-3-3，Teg20，Ubiquitin C后各自蛋白表达水平均呈显著下降，Caspase3/7活性显著升高，干扰后虫体体被同样发生明显损伤，虫子活性降低，死亡数量上升，提示SjIAP与其互作分子14-3-3, Teg20, ubiquitin C可能共同参与日本血吸虫细胞凋亡的负调控。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 血吸虫及血吸虫病概述

1．1．1 介绍

1．1．2 血吸虫的分类学

1．1．3 血吸虫的生活史

1．1．4 血吸虫生活史

1．1．5 流行病学和预防

1．1．6 诊断

1．1．7 治疗

1．2 凋亡蛋白抑制因子

1．2．1 IAPs作为细胞信号通路的调节因子

1．2．2 IAPs和肿瘤坏死因子受体超级家族

1．2．3 IAPs和Smac模拟物

第二章 日本血吸虫凋亡抑制因子的RNA干扰研究

2．1 材料

2．1．1 生物材料

2．1．2 生化试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 引物合成及siRNA合成

2．1．5 主要试剂的配制

2．2 方法

2．2．1 日本血吸虫收集

2．2．2 日本血吸虫的体外培养

2．2．3 日本血吸虫的IAP体外干扰

2．2．4 SjIAP干扰后Total RNA的提取

2．2．5 Total RNA逆转录

2．2．6 SjlAP干扰后qRT-PCR检测

2．2．7 荧光定量数据处理

2．2．8 SjlAP干扰后虫体蛋白的提取

2．2．9 SjlAP干扰后Caspase 3／7活性的检测

2．2．10 SjlAP干扰后Western blot检测

2．2．11 SjIAP干扰后的扫描电镜观察

2．2．12 SjIAP干扰后虫体活性的检测

2．2．13 SjIAP免疫组化分析

2．3 结果

2．3．1 干扰IAP后日本血吸虫total RNA的提取

2．3．2 SjIAP干扰后qRT-PCR检测

2．3．3 SjlAP干扰后Western blot检测

2．3．4 SjlAP干扰后Caspase 3／7活性的检测

2．3．5 SjlAP干扰后的扫描电镜观察

2．3．6 SjIAP干扰后虫体活性的检测

2．3．7 SjlAP的免疫组化定位

2．4 结论

第三章 SjlAP互作分子14-3-3，Teg20及Ubiquitin C最佳siRNA分子筛选

3．1 材料

3．1．1 生物材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 引物合成及siRNA合成

3．1．4 主要仪器

3．1．5 主要试剂的配制

3．2 方法

3．2．3 日本血吸虫的14-3-3，Teg20，Ubiquitin C的体外干扰

3．2．5 日本血吸虫14-3-3，Teg20，Ubiquitin C干扰后Total RNA逆转录

3．2．6 日本血吸虫14-3-3，Teg20，Ubiquitin C干扰后qRT-PCR检测

3．2．7 荧光定量数据处理

3．3 结果

3．3．2 SjIAP互作分子14-3-3，Teg20和Ubiquitin C在日本血吸虫不同发育时期转录水平

3．3．3 14-3-3，Teg20及Ubiquitin C干扰日本血吸虫的siRNA筛选干扰效果评估

3．4 讨论

第四章 SjIAP互作分子14-3-3，Teg20及Ubiquitin C的功能研究

4．1 材料

4．1．1 生物材料

4．1．2 生化试剂

4．1．3 仪器

4．1．4 引物合成及siRNA合成

4．1．5 主要试剂的配制

4．2 方法

4．2．1 日本血吸虫的收集

4．2．2 日本血吸虫的体外培养

4．2．7 日本血吸虫14-3-3，Teg20及Ubiquitin C干扰后扫描电镜观察

4．3．2 日本血吸虫14-3-3．Teg20和Ubiquitin C干扰后的扫描电镜观察

4．3．3 日本血吸虫14-3-3，Teg20和Ubiquitin C干扰后虫体活性的检测

4．3．4 日本血吸虫14-3-3，Teg20和Ubiquitin C干扰后Caspase 3／7活性检测

4．4 讨论

第五章 全文总结

参考文献

致谢

作者简介