日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP功能的初步研究

摘要

血吸虫感染引起的血吸虫病仍然是危害人类健康的一种重要的公共卫生疾病。在我国较为流行的是日本血吸虫病，但是目前没有可以有效防治血吸虫感染的疫苗。血吸虫病的治疗主要还是依赖于化学药物吡喹酮，但是该药物不能防止血吸虫的重复感染，因此迫切需要对血吸虫生长发育机理进行深入研究，探索血吸虫防治的新方法。前期研究发现凋亡抑制因子可能在血吸虫发育和寄生过程中发挥重要作用，其中凋亡抑制蛋白(IAP)通过杆状病毒IAP的重复域(BIR)在调控凋亡进程中发挥着重要的作用，有可能是血吸虫病控制的一个潜在的药物新靶标。本研究通过生物信息学分析发现了一个新的日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP，针对该凋亡抑制因子，本文开展以下三个方面的研究:
　　（一）日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP的克隆表达及生物信息学分析
　　通过生物信息学分析，发现一个与小鼠直系同源的血吸虫BIRP(GenBank ID:AAW27178.1)，利用PCR方法我们成功扩增出来日本血吸虫SjBIRP的cDNA片段，序列分析表明扩增的该cDNA片段包含一个765bp的开放阅读框，编码一个预测分子量为20.14kDa的BIRP蛋白。多重序列分析表明日本血吸虫的BIRP序列与人有50％的相似性，与褐家鼠有44.0％的相似性，与小家鼠有46％的相似性。系统发育树分析显示SjBIRP序列定位于无脊椎动物组中，与脊椎动物组相距较远。另外，构建了SjBIRP的原核质粒，并获得原核表达重组蛋白，该蛋白经过了ESI-Q-TOF质谱鉴定分析。
　　（二）日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP在血吸虫不同期别、性别和不同宿主中的表达分析
　　利用实时定量PCR分析显示日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP在血吸虫不同发育阶段(7d，14d，21d，28d，35d，42d)、不同性别（雌雄）和不同宿主（小鼠、大鼠和新西兰大白兔）中的表达情况。结果显示，SjBIRP在日本血吸虫7个时期均有表达，尤其在童虫(7d)的时候显著升高。另外，SjBIRP在雌虫中的表达显著高于雄虫，在宿主大鼠中虫体的表达高于小鼠和新西兰大白兔中虫体，表明日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP可能在血吸虫发育和寄生调控中发挥重要作用。
　　（三）日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP的功能研究
　　将纯化的重组融合蛋白rSjBIRP，注射到BALB/c小鼠皮下，制备了多克隆抗体，ELISA分析表明血清效价为1∶6400，进一步通过Western blot分析显示rSjBIRP多克隆抗体有较好的特异性。另外，构建了SjBIRP真核表达质粒，转染哺乳动物细胞，发现SjBIRP质粒能够抑制Act D诱导的细胞凋亡。进一步研究表明rSjBIRP也能够抑制虫体组织裂解液中的caspase3/7的活性，表明SjBIRP可能参与血吸虫的细胞凋亡调控。
　　总之，本研究初步表明SjBIRP可能在血吸虫发育和寄生过程中发挥着重要调控功能，有可能是作为血吸虫病控制的一个潜在的药物靶标。

目录

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摘要

英文缩列表

第一章 引言

1．1 血吸虫及血吸虫病概况

1．2 细胞凋亡抑制因子的研究进展

1．2．1 凋亡抑制蛋白研究概述

1．2．2 IAPs

1．2．3 细胞凋亡抑制因子与疾病发生

第二章 日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP克隆表达的分子特性

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 生物信息学分析sjBIRP序列

2．2．2 PCR扩增及载体构建

2．2．3 表达、纯化和鉴定重组蛋白SjBIRP

2．2．4 SjBIRP蛋白结构预测

第三章 SjBIRP在日本血吸虫不同的发育阶段、性别和不同终末宿主体中的表达差异

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与讨论

3．2．1 SjBIRP在血吸虫不同发育阶段中的表达

3．2．2 SjBIRP在血吸虫不同性别中的表达

3．2．3 SjBIRP在不同终末宿主中的表达

第四章 日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP的体外功能研究

4．1 材料和方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 ELISA分析血清效价及Western blot检测多克隆抗体的特异性

4．2．2 真核质粒pcDNA3．1(+)-BIRP构建

4．2．3 真核质粒转染浓度和表达时间优化

4．2．4 Act D诱导细胞凋亡

4．2．5 SjBIRP对Hela细胞和虫体裂解液中的caspase活性的影响

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

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