小鼠骨骼肌发育相关环状RNA的鉴定和功能研究

摘要

骨骼肌的发育受遗传和表观遗传的调控，调控肌肉发育的基因主要有生肌调节因子家族，肌细胞增强因子家族，Pax基因家族以及myostatin基因等。除此之外，随着生物技术和信息技术的发展，越来越多的非编码基因逐渐被挖掘出来，主要包括有长链非编码RNA(Long noncoding RNA，LncRNA)、微小RNA(MicroRNA)以及成为研究热点的环状RNA(Circular RNA，circRNA)等。环状RNA是一种广泛存在于生物界的一种非编码RNA，是mRNA前体选择性剪切形成的产物。环状RNA主要由外显子环化形成，少部分由内含子形成，还有部分由外显子和内含子共同形成。研究表明，环状RNA具有海绵(sponge)作用，充当miRNA的环状抑制剂，调控miRNA靶标发挥作用，参与转录后的调控，进而参与机体的调控功能。然而，与骨骼肌发育相关的环状RNA却鲜有报道。
　　本文以C2C12小鼠成肌细胞为模型，通过芯片筛选出与肌肉发育相关的两条环状RNA--Circ2196和Circ2179，主要研究其对C2C12细胞增殖、分化的影响。实验结果表明Circ2179可以促进细胞的分化，Circ2196可以抑制细胞的增殖。为研究其作用机制，对这两个环状RNA进行细胞定位，发现二者均主要位于细胞质中，为研究环状RNA的海绵(sponge)作用奠定了基础。通过生物信息学分析，Circ2196上有与miR133a、miR133b和miR133c等miRNAs结合的位点，通过双荧光素酶报告系统研究发现，Circ2196可以与miR133a、miR133b和miR133c靶向结合，通过细胞增殖实验发现Circ2196可以抑制这三种miRNAs的活性。敲低Circ2196之后，这三种miRNA的活性提高，促进了细胞的增殖。前人研究显示miR133a和miR133b可以通过抑制SRF蛋白活性来促进细胞的增殖，本实验通过western blotting发现Circ2196敲低之后，SPF蛋白的表达与对照组(NC)相比显著降低，Circ2196过表达之后，SRF蛋白的表达与对照组(NC)相比显著升高，研究结果与其一致，进一步说明Circ2196对miR-133家族的调控作用。本研究揭示了Circ2196抑制C2C12成肌细胞的增殖，并研究了Circ2196的作用机制—即通过抑制miRNA-133家族来促进SRF蛋白表达，进而抑制C2C12成肌细胞的增殖，为进一步研究Circ2196在肌肉发育过程中调控作用提供了重要的理论依据。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 骨骼肌的发育

1．2 参与骨骼肌发育调节的基因

1．2．1 生肌调节因子家族和肌细胞增强因子家族

1．2．2 Pax基因家族

1．2．3 肌肉生长抑制因子(MSTN)

1．2．4 非编码基因

1．3 环状RNA的概述

1．3．1 环状RNA的成环方式

1．3．2 环状RNA的主要特征

1．3．3 环状RNA的功能研究

1．4 环状RNA研究策略

1．4．1 环状RNA鉴定与差异筛选

1．4．2 环状RNA的生物信息学分析

1．4．3 环状RNA的功能验证

1．5 miRNAs的简介

1．5．1 miRNAs的生成机制

1．5．2 miRNAs的作用机制及作用

1．5．3 miRNAs在肌肉发育中的作用

1．6 环状RNA在肌肉发育中研究的现状

第二章 实验仪器设备、材料与方法

2．1 实验仪器设备

2．2 实验材料及试剂及配制

2．2．1 实验材料

2．2．2 试剂配制

2．3 实验方法

2．3．1 细胞复苏

2．3．2 细胞传代

2．3．3 细胞冻存

2．3．4 细胞分化

2．3．5 细胞转染

2．3．6 CCK8细胞增殖测定实验

2．3．7 C2C12细胞的流式分析

2．3．8 C2C12细胞核质分离实验

2．3．9 细胞RNA提取

2．3．10 RNA的反转录(cDNA的合成)

2．3．11 miRNA的反转录

2．3．12 荧光定量PCR(qPCR)体系及反应程序

2．3．13 环状RNA的酶切实验(RNase R)

2．3．14 基因克隆

2．3．15 环状RNA与miRNA结合位点的靶标验证

2．3．16 环状RNA的过表达

2．3．17 细胞蛋白质提取及Western Blotting实验

2．4 本实验所用引物

第三章 实验结果

3．1 环状RNA的芯片检测

3．1．1 总RNA的提取与质检结果

3．1．2 环状RNA芯片检测的结果

3．1．3 环状RNA的差异表达研究

3．2 环状RNA的鉴定分析及其表达量检测

3．2．1 PCR扩增

3．2．2 Rnase R酶切

3．2．3 环状RNA的表达量验证

3．3 环状RNA的细胞定位

3．4 环状RNA的敲低实验

3．5 Circ2196敲低后对C2C12成肌细胞增殖的影响

3．6 Circ2196敲低后对C2C12成肌细胞周期的影响

3．7 Circ2179敲低后后对C2C12成肌细胞对分化的影响

3．8 环状RNA与miRNA的作用

3．8．1 环状RNA与miRNA结合位点预测

3．8．2 环状RNA与miRNA结合位点(靶标)的荧光索酶的验证

3．8．3 Circ2196敲低后相应miRNA的表达量

3．8．4 过表达miRNAs后circ2196的表达量

3．8．5 siRNA、miRNA、inhibitor共转染对C2C12细胞增殖的影响

3．9 Circ2196过表达实验

3．10 Circ2196敲低和过表达对miRNA-133靶标基因SRF表达的影响

3．11 Circ2196和Circ2179的时空表达谱

第四章 讨论

5．1 本论文研究结论

5．2 论文创新点

5．3 后续实验安排

参考文献

附录

致谢

作者简历