猪瘟C株疫苗免疫猪CD8+T细胞TCRα、β链CDR3谱系及分子特征初步分析

摘要

抗原特异性T细胞受体(T cell receptor, TCR)克隆性研究已被广泛应用于人类疾病的诊断和治疗，但在动物疫病特别是猪瘟上未见报道。本研究用猪瘟C株疫苗刺激机体产生针对猪瘟病毒的免疫应答，通过分析刺激前后外周血CD8+T细胞TCR互补决定区3(complementaritydetermining region3，CDR3)谱型，从CD8+T细胞中筛选出猪瘟抗原特异的TCR基因家族，通过二次刺激进行进一步的筛选。将筛选出的呈现明显单克隆或寡克隆性扩增的TCR家族CDR3序列通过PCR法克隆到T载体上，挑取多个克隆测序，寻找出多个克隆CDR3区出现相同基因序列和保守基序的TCR基因。结果显示:猪瘟C猪疫苗免疫后，外周血CD8+T细胞中存在单克隆和寡克隆增殖的TCR家族，并呈现规律性消长变化和保守的氨基酸模序，表明单克隆和寡克隆增殖的TCR家族与猪瘟病毒抗原肽的识别存在相关性，在一定程度上为猪瘟病毒T细胞表位的挖掘和新型疫苗的开发提供理论支持。本研究取得如下进展:
　　1.明确了初次免疫前后CD8+T细胞αβTCR的谱型变化特征。通过RT-PCR扩增CD8+T细胞19个TRAV家族和20个TRBV家族CDR3，利用基因扫描-谱型分析技术分析TCR CDR3谱型分布。谱型结果表明，免疫前几乎所有TRAV/BV家族CDR3呈典型的高斯分布，绝大多数家族含有8条以上不同荧光强度、不同序列长度的峰。免疫后，一些TCR家族呈现克隆性增殖，并且其克隆性增殖维持一定时间后，在第15d又恢复到免疫前的高斯分布。CDR3谱型的变化规律暗示这些克隆性增殖的TCRAV和BV家族与猪瘟病毒的感染存在相关性。
　　2.明确了二次免疫后血清抗体滴度变化特征。相较于初次免疫，二次免疫后血液中抗体浓度上升快，抗体效价高，抗体高峰持续时间长。表明初次免疫后机体对疫苗产生了有效的免疫记忆，再次接种后机体免疫系统迅速反应，产生高效的免疫应答，符合记忆性免疫的特征。
　　3.明确了二次免疫后CD8+T细胞αβTCR的谱型变化规律。同初次免疫类似，二次免疫前大部分TRAV/BV家族CDR3呈典型的高斯分布;不同的是，二次免疫后，克隆性增殖家族出现的时间早于初次免疫，持续时间长，而且克隆性增殖的TCR家族其优势克隆峰RI值明显强于初次免疫。同时我们发现， P1猪的AV8-3S、AV22，P2猪的AV4S，P4猪的DV1、BV15S在初次免疫和二次免疫后均呈现克隆性增殖。提示二次免疫后，猪瘟病毒相关的记忆性T细胞被活化并呈现克隆性增殖。
　　4.成功地对二次免疫后呈现克隆性扩增的的TRAV和TRBV家族CDR3序列结构特征进行了分析。PCR扩增克隆性增殖TCR基因家族CDR3，并进行测序和生物信息学分析。结果发现，大部分克隆性增殖的家族其CDR3具有保守的氨基酸基序。对于克隆性增殖的TRAV家族，“KL”氨基酸基序在五个家族的四个均有出现，各家族内也各自存在保守基序;对于克隆性增殖的TRBV家族，“QY”氨基酸基序在七个冢族的五个中均出现，“GG”在七个家族的六个中均出现。另外，AV22、AV4、BV27和BV15四个克隆性增殖的家族，均存在高频率表达的氨基酸序列，即优势表达序列。我们对上述四个家族在呈现克隆性增殖的另一时间点进行再测序，发现这些优势表达序列同样显现高频率表达;而免疫前四个家族呈现异质化表达，没有发现优势表达序列。上述规律提示CD8+T细胞TRAV和TRBV家族CDR3的这些优势表达序列和保守的氨基酸基序可能与猪瘟病毒抗原肽的特异性识别和结合有关。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1 前言

1．2 TCR的抗原识别作用

1．3 αβTCR作为健康和疾病的预测因子

1．3．1 胸腺选择前TCR库的多态性

1．3．2 初始T细胞TCR库的多样性

1．3．3 抗原特异性反应中的TCR偏好性

1．3．4 健康和疾病状态下TCR的多样性

1．4 CDR3谱型分析在TCR与疾病相关性研究中的应用

1．4．1 免疫介导的疾病

1．4．2 感染性疾病

1．4．3 血液肿瘤

1．4．4 实体瘤

1．5 CDR3谱型分析在猪瘟病毒感染中的研究意义

第二章 猪瘟C株疫苗初次免疫后CD8+T细胞αβTCR谱型变化及其克隆化分析

2．1 材料和方法

2．1．1 试验动物

2．1．2 主要试剂和试剂盒

2．1．3 主要溶液

2．1．4 引物设计与合成

2．1．5 免疫接种

2．1．6 采血

2．1．8 密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞(PBMCs)

2．1．9 免疫磁珠法分选CD8+T细胞

2．1．10 RNA的提取

2．1．11 cDNA的合成

2．1．14 CDR3谱型分析

2．2 试验结果

2．2．1 抗体检测

2．2．2 TRAV和TRBV家族RT-PCR结果

2．2．3 基因扫描分析初次免疫前后TCR CDR3谱型变化

2．3 讨论

第三章 猪瘟C株疫苗二次免疫前后CD8+T细胞αβTCR谱型变化及其克隆化分析

3．1 材料和方法

3．1．1 试验动物及试剂

3．1．2 引物设计与合成

3．1．3 免疫接种

3．1．4 采血

3．1．5 抗体检测

3．1．8 密度梯度离心法分离、纯化猪外周血单个核细胞(PBMCs)

3．1．9 免疫磁珠法分选CD8+T细胞

3．1．10 RNA的提取

3．1．14 CDR3谱型分析

3．2 试验结果

3．2．1 抗体检测

3．2．2 TRAV和TRBV家族RT-PCR结果

3．2．3 基因扫描分析二次免疫前后TCR CDR3谱型变化

3．3 讨论

第四章 克隆性增殖的CD8+T细胞TRAV和BV家族CDR3序列分析

4．1 材料和方法

4．1．1 菌种

4．1．2 主要试剂和试剂盒

4．1．3 引物设计与合成

4．1．4 克隆性增殖CD8+T细胞TRAV和TRBV家族的PCR扩增

4．1．5 克隆载体的构建

4．2．2 克隆性增殖CD8+T细胞TRAV和TRBV家族CDR3序列分析

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历