鹿茸干细胞的鉴定以及鹿茸再生关键调控基因的筛选

摘要

实现器官再生是再生生物学和再生医学追求的终极目标。割处再生，在器官再生领域是最困难也是最引人注目的。割处再生是动物在剩余肢体的断端再生出失去那部分肢体的再生过程。迄今为止，割处再生的认识主要来自低等两栖动物，以蝾螈为例，肢体割处再生是通过已分化细胞去分化，形成干细胞群组成的芽基实现肢体再生。鹿茸是哺乳动物中罕见的能够周期性完全再生的附属器官，这就为我们提供了一个非常好的研究哺乳动物肢体再生的模型。通过组织学研究和动物实验发现，鹿茸再生是一个基于干细胞的再生过程，这与蝾螈的肢体再生的去分化过程存在本质上的差别。鹿茸干细胞(Antler stem cells，ASCs)定位于生茸区骨膜(Antlerorgenic periosteum，AP)和角柄骨膜(Pedicle periosteum，PP)以及快速生长的鹿茸尖部，对ASCs进行鉴定和探讨其特异性表达的调控因子是揭示鹿茸再生机制的关键。
　　本研究聚焦于ASCs，系统地比较ASCs在细胞、蛋白和基因水平与常见的MSC特别是脸部骨膜(Facial periosteum)细胞的异同，通过蛋白组学和转录组学的研究筛选ASCs中特异性表达的调控因子和相关信号通路，从中找到决定鹿茸再生的关键调控因子。结果显示ASCs在细胞增殖、凋亡、周期分布等细胞水平与脸部骨膜细胞差异不显著，但是在成单克隆潜能上显著高于普通骨膜细胞;没有在ASCs中检测到Oct4、Nanog等ESC标记因子，CD73、CD90、CD105和Stro-1等经典的MSC标记因子在ASCs中均有表达;此外神经干细胞主要标记因子Nestin在ASCs中也高表达。
　　通过转录组测序，一共注释得到402个与干细胞有关的基因，涉及到干细胞的维持、分化、增殖、迁移等，其中与干细胞维持有关的基因达到220个。注释的干细胞相关基因中有25个与ESC标记基因一致（总共50个）;11个与MSC标记基因一致（共13个）;19个与骨祖细胞标记基因一致（共24个）。从转录水平为ASCs在整个干细胞群中进行了定位。通过差异基因筛选得到ASCs中上调基因1413，下调基因1252个。GO聚类分析发现ASCs相对于普通骨膜细胞的差异基因功能聚类于多分化潜能、干细胞维持、干细胞分化、组蛋白甲基化、DNA甲基化等生物学过程。通过蛋白组学的研究，筛选了ASCs中差异性表达的蛋白，通过质谱鉴定出差异蛋白点96个。这些差异蛋白涉及到细胞增殖与凋亡、细胞吞噬、有丝分裂、糖酵解、细胞周期和NOD受体信号通路等。筛选到Hsp90、Hsp47、Galectin-1和S100A4等与肿瘤生长有关的调控因子。
　　结论如下:1）ASCs在细胞增殖、凋亡、周期分布等细胞水平与脸部骨膜细胞差异不显著;2) ASCs表达经典MSC标记因子(CD73、CD90、CD105和Stro-1);3）ASCs相对于普通骨膜细胞上调的基因聚类于多分化潜能、干细胞维持、干细胞分化、组蛋白甲基化、DNA甲基化等生物学过程，包括细胞的增殖、细胞周期调控、细胞凋亡和NOD受体信号通路等;蛋白质聚类于细胞增殖与凋亡、细胞吞噬、有丝分裂、糖酵解、细胞周期和NOD受体信号通路等;4）蛋白组与转录组的结果进行比较，虽然具体到单个基因或者蛋白两者一致性较弱，放大到生物过程或者信号通路的富集显示两者的吻合度非常高。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1．1 鹿茸再生的概述

1．1．2 鹿茸的组织发生与结构

1．2 鹿茸再生的调控

1．2．1 激素调控

1．2．2 生长因子调控

1．2．3 信号通路调控

1．3 鹿茸干细胞

1．3．1 干细胞标记物

1．3．2 多分化潜能

1．3．3 干细胞微环境

1．4 鹿茸再生模型的特点

1．4．1 再生茸芽VS经典的再生芽基

1．4．2 鹿茸干细胞VS去分化细胞

1．4．3 鹿茸再生过程VS肢体愈合过程

1．5 本研究的目的及意义

第二章 鹿茸细胞培养与初步鉴定

2．1 材料和方法

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验器材

2．1．3 实验试剂

2．1．4 组织采集

2．1．5 细胞培养

2．1．6 细胞增殖检测

2．1．7 细胞周期检测

2．1．8 细胞凋亡检测

2．1．9 细胞迁移检测

2．1．10 单克隆形成

2．2 结果

2．2．1 细胞培养结果

2．2．2 鹿茸细胞增殖

2．2．3 鹿茸细胞的周期分布

2．2．4 鹿茸细胞的凋亡

2．2．5 鹿茸细胞迁移

2．2．6 鹿茸细胞形成单克隆

2．3 讨论

2．4 本章小结

第三章 经典干细胞标记因子检测

3．1 材料和方法

3．1．1 实验器材

3．1．2 主要试剂

3．1．3 RNA样品准备

3．1．4 成骨诱导分化(微粒体培养)

3．1．5 成脂诱导分化

3．1．6 Western-blot检测

3．1．7 微粒体染色

3．1．8 免疫荧光检测

3．1．9 流式细胞仪分析

3．2 结果

3．2．1 胚胎干细胞标记因子的检测

3．2．2 间充质干细胞标记因子的检测

3．2．3 Nestin在ASCs中的表达

3．2．4 多分化潜能

3．3 讨论

3．3 本章小结

第四章 转录组筛选鹿茸干细胞差异因子

4．1 材料和方法

4．1．1 实验器材

4．1．2 主要试剂

4．1．3 RNA样品准备

4．1．4 转录组测序

4．1．5 测序结果验证

4．1．6 免疫荧光检测

4．1．7 流式细胞仪分析

4．2 结果

4．2．1 转录组测序结果

4．2．2 qPCR验证测序结果

4．2．3 标准干细胞因子比较

4．3 讨论

4．4 本章小结

第五章 蛋白组学筛选鹿茸干细胞标记因子

5．1 材料和方法

5．1．1 实验器材

5．1．2 主要试剂

5．1．3 蛋白样品准备

5．1．4 双向电泳

5．1．5 扫描与图像分析

5．1．6 差异蛋白的生物信息学分析

5．1．8 免疫荧光检测

5．1．9 免疫组化

5．1．10 流式细胞仪分析

5．1．11 HUVEC成管实验

5．2 结果与分析

5．2．1 2D-DIGE电泳结果

5．2．2 质谱鉴定结果

5．2．3 差异蛋白生物信息学分析

5．2．4 差异蛋白验证

5．2．5 S100A4功能分析

5．3 讨论

5．4 本章小结

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历