转基因棉花MON531R7569中截短cry1Ac基因表达的初步分析

摘要

转基因抗虫棉是目前我国种植面积最大的转基因作物。美国孟山都公司研发的一代抗虫棉MON531转化体已在我国批准商业化种植和应用超过20年。MON531R7569是本实验室发现的与MON531转化体具有相同旁侧序列但cry1Ac基因发生截短的转基因棉花材料。本研究验证了MON531R7569的分子结构，建立了其检测方法，分析了截短cry1Ac基因的转录及蛋白表达水平，初步分析了cry1Ac基因的甲基化情况，主要结果有以下五个方面.
　　1.采用PCR方法验证了MON531R7569的外源整合结构，并建立了MON531R7569的特异性定量PCR检测方法。结果表明:MON531R7569的转基因整合结构与MON531整合结构相同，但cry1Ac基因3'端序列及终止子区域发生缺失。基于cry1Ac基因重组区域建立了定量检测方法，对476份市场转基因棉花的定量分析表明有4份样品检出MON531R7569，含量最高为1.56％。
　　2.利用RACE和RT-PCR方法分析了MON531R7569的cry1Ac基因转录本和转录水平。转录本分析表明MON531R7569的cry1Ac基因转录终止位点主要集中在截短位置下游161-173和233-265碱基处。转录水平分析表明MON531R7569和MON531的叶片中cry1Ac基因的转录水平随苗期、蕾期、铃期逐渐下降，MON531R7569苗期和蕾期叶片中的cry1Ac基因转录水平均显著高于MON531，但铃期叶片中无显著差异。
　　3.采用ELISA方法测定了MON531R7569中Cry1Ac蛋白表达量。结果表明叶片中Cry1Ac蛋白表达量随苗期、蕾期、铃期逐渐下降，三个时期的Cry1Ac蛋白表达量均高于MON531。
　　4.采用离体叶片法测定了对MON531R7569苗期叶片对棉铃虫的抗性。结果表明MON531R7569转基因抗虫棉对棉铃虫幼虫的校正死亡率为99.47％，转基因抗虫棉MON531R7569的抗性水平为高抗;MON531转基因抗虫棉对棉铃虫的校正死亡率为95.21％，转基因抗虫棉MON531的抗性水平为高抗。
　　5.采用甲基化敏感内切酶定量PCR方法(MSRE-qPCR)和亚硫酸盐测序法(BS-seq)，分析了MON531R7569和MON531中cry1Ac基因表达框序列的甲基化水平。结果显示全部13个HpyCH4IV位点中MON531R7569有3个位点甲基化水平高，位于截短cry1Ac基因阅读框之外。而MON531有5个位点甲基化水平高，位于cry1Ac基因的3'端区域及邻近区域。BS-seq结果显示MON531R7569的甲基化区域长度约300bp。
　　本研究中MON531R7569的截短cry1Ac基因转录、表达、抗虫性和甲基化的结果表明:cry1Ac基因能够稳定表达外源杀虫蛋白并具有良好的杀虫活性。本研究为转基因分子特征的个案化安全性分析提供了重要参考和思路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 转基因作物发展现状

1．2 转基因生物监管及标识制度

1．3 转基因作物检测技术发展

1．3．1 转基因作物外源核酸的PCR检测技术

1．3．2 转基因作物外源蛋白检测技术及其他检测技术

1．4 转基因整合特点

1．5 转基因植物分子特征

1．6 转基因作物中杀虫蛋白的表达及其影响因素

1．6．2 其他转基因作物中抗虫基因的表达研究

1．6．3 影响转基因作物外源蛋白表达的因素

1．7 研究背景、内容及意义

1．7．2 研究内容

第二章 MON531R7569插入结构验证及检测方法的建立

2．1 实验试剂及仪器

2．2 样品制备

2．2．2 基因组DNA提取

2．3 引物设计

2．3．1 结构验证引物设计

2．3．2 外源整合结构验证引物设计

2．3．3 定量检测方法的引物设计

2．4 PCR扩增

2．4．3 定量PCR

2．5 结果与分析

2．5．2 MON531R7569外源插入结构的验证

2．5．3 定量检测方法的建立及应用

2．6 讨论与分析

第三章 MON531R7569中cry1Ac基因的转录分析

3．2．2 总RNA提取

3．3 RACE分析

3．3．1 RACE引物设计

3．3．2 RACE Ready cDNA的合成

3．3．4 PCR产物克隆测序

3．4 RT-PCR

3．4．4 RT-PCR

3．4．5 RT-PCR数据处理

3．5 结果分析

3．5．1 MON531R7569的cty1Ac基因的转录本分析

3．5．2 MON531R7569的cry1Ac基因转录分析

3．6 结论与讨论

第四章 MON531R7569中Cry1Ac蛋白的表达分析

4．3 Cry1Ac蛋白含量测定

4．4 数据统计数据分析

4．6 结论与讨论

第五章 转基因棉花MON531R7569室内抗虫性测定

5．4 杀虫蛋白含量测定

5．5 数据处理

5．6 结果分析

5．6．1 棉铃虫取食棉花叶片情况

5．6．2 转基因抗虫棉抗虫性测定

5．6．3 Cry1Ac杀虫蛋白含量测定

5．7 结论与讨论

第六章 cry1Ac基因序列的甲基化分析

6．3 引物设计

6．4．2 酶切基因组DNA

6．5．3 产物克隆测序

6．6 数据处理

6．7．3 cry1Ac基因甲基化序列区域亚硫酸盐测序

6．8 结论与讨论

第七章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历