转化体叠加的转基因棉花cry1Ac基因表达及启动子甲基化分析

摘要

转Bt抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，在我国已有20年种植历史。外源基因表达稳定性一直是转基因遗传分析和分子特征评价的重要内容，为了深入研究转Bt抗虫棉外源基因表达稳定性，本研究以保铃棉中的MON531转化体(MON531)、7S非功能插入(简称7S)，以及与MON531相同载体的MON757转化体(MON757)为研究材料，分析了单个转化体插入和复合转化体插入在外源杀虫蛋白表达、mRNA转录和启动子甲基化水平上的差异，主要研究结果如下:
　　1.以棉花基因组与插入序列的连接区为靶标，建立7S的定性、定量PCR检测方法。利用建立的方法分析了2014年我国湖北省市售的48份转基因棉花种子，有8份检测到7S非功能插入，定量PCR检测表明，其含量介于0.46％-34.39％。进一步跟踪检测表明，保铃棉531中7S非功能插入与抗虫功能性插入在遗传上不连锁。
　　2.利用ELISA方法测定MON531、MON757、7S及其复合转化体Cry1Ac蛋白表达情况。对3个市场棉种材料研究表明，7S非功能插入不影响MON531中Cry1Ac蛋白表达;对具有相同遗传背景的纯合MON531、MON757及其复合转化体(MON531/MON757)五个阶段（亲代种子、苗期、蕾期、铃期、子代种子）Cry1Ac蛋白表达进行跟踪检测，表明MON757高于MON531，而MON531/MON757显著低于两个单一转化体（除子代种子）。
　　3.通过实时荧光定量PCR分析了MON531、MON757及MON531/MON757中cry1Ac基因在苗期、蕾期、铃期的转录情况。结果表明，mRNA转录整体呈现先升后降的总趋势;MON757中cry1Ac基因始终处于较高水平的转录，与MON531保持大致的两倍关系;复合转化体MON531/MON757中cry1Ac基因剂量在DNA水平上较MON531、MON757增加一倍，但mRNA转录水平却显著低于单一转化体(p＜0.05)。
　　4.运用亚硫酸盐测序法(BSP)分析比较MON531、MON757、MON531/MON757全长cry1Ac基因35S启动子甲基化水平变化。结果表明，不同生育期的MON531在CG、CHG、CHH及总甲基化率变化差异小，亲代为1.0％-1.7％，苗期为4.2％-5.0％，子代为0.8％-1.3％;MON757在CG、CHG区段的甲基化率约为MON531两倍，除子代外两者在CHH区域及总甲基化水平差异较小;复合转化体MON531/MON757启动子功能区甲基化主要集中于CG、CHG，不同世代甲基化率高达55.0％以上，显著高于两个单一转化体;CpG区域分析表明，不同时期的MON531、MON757目标基因启动子均处于低水平甲基化，但两者复合后该区域呈现显著的甲基化增高。
　　本研究针对保铃棉531中7S非功能插入建立特异性定性、定量PCR检测方法，对市场棉种进行了初测，为转基因抗虫棉安全管理提供检测技术手段;对同一转化事件的MON531、MON757、7S及其复合转化体进行目的蛋白检测，初步探索了不同转化体复合后的蛋白变化关系;从mRNA转录水平、启动子甲基化水平揭示了多基因复合后的基因沉默现象。这一研究的深入推进，可为今后新品种培育提供参考，同时也对复合转基因安全评价提出更高要求:不能仅仅局限于单一转化体安全评价，应更多的关注基因间相互作用产生的表观遗传变化。

目录

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摘要

第一章 引言

1．1 转基因作物发展概况

1．1．1 全球转基因作物研发、种植情况

1．1．2 我国转基因棉花研发、种植情况

1．1．3 转基因作物安全性问题讨论及风险评估

1．2 转基因检测技术研究进展

1．2．1 常见外源蛋白检测技术

1．2．2 常见外源核酸检测技术

1．3 外源基因蛋白表达及转录研究

1．3．1 转基因棉花外源蛋白表达研究

1．3．2 转基因玉米外源蛋白表达

1．3．3 转基因水稻外源蛋白表达

1．3．4 复合转基因表达与转录研究

1．4 研究背景、内容及意义

1．4．1 研究背景

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究意义

第二章 保铃棉中7S非功能插入检测方法建立及运用

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂、仪器及设备

2．1．3 样品制备及基因组DNA提取

2．1．4 7S非功能插入序列定性PCR检测方法的建立

2．1．5 7S非功能插入的定量PCR检测方法建立

2．1．6 我国转基因棉花种子中7S非功能插入序列的检测

2．2 实验结果与分析

2．2．2 我国棉花种子中7S非功能插入的定性检测分析

2．2．3 7S非功能插入序列定量PCR方法标准曲线制备

2．2．4 我国棉花种子中7S非功能插入片段的定量检测

2．3 讨论与分析

第三章 复合转基因棉花Cry1Ac蛋白表达分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂、仪器及设备

3．1．3 田间设计

3．1．4 核酸鉴定

3．1．5 cry1Ac外源蛋白检测

3．2 结果与分析

3．2．1 检测方法测试

3．2．2 身份特征鉴定

3．2．3 Cry1Ac蛋白测定

3．3 讨论

第四章 复合转基因棉花cry1Ac基因转录分析

4．1 材料与方法

4．1．1 棉花材料

4．1．2 主要试剂及仪器

4．1．3 实验设计及采样处理

4．1．4 总RAN提取

4．1．5 cDNA第一链合成

4．1．6 引物设计及优化

4．1．7 荧光定量分析

4．1．8 数据处理

4．2 结果与分析

4．2．1 材料鉴定及RNA提取

4．2．2 荧光定量引物测试

4．2．3 荧光定量标准曲线构建

4．2．4 转录分析

4．3 讨论与分析

第五章 复合转基因棉花cry1Ac基因启动子甲基化分析

5．1 材料与方法

5．1．1 棉花材料

5．1．2 主要试剂及仪器

5．1．3 基因组DNA提取

5．1．4 亚硫酸盐转化

5．1．5 目标启动子PCR扩增

5．1．6 克隆测序

5．1．7 数据处理

5．2 结果与分析

5．2．1 DNA提取及PCR扩增鉴定

5．2．2 甲基化PCR

5．2．3 DNA甲基化水平测序分析

5．2．4 复合转基因35S启动子CpG区域分析

5．3 讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历