蒺藜苜蓿细胞色素P450基因的克隆及功能分析

摘要

植物细胞色素P450(CYP450)超基因家族编码的单加氧酶参与多种催化反应，在植物防御非生物胁迫中具有重要作用。本文分析了豆科模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中MtCYP450表达特性及功能，以期为改善豆科牧草耐盐性提供参考。主要研究结果如下:
　　1、克隆蒺藜苜蓿MtCYP450并进行生物信息学分析。该基因编码508个氨基酸，蛋白分子量为58.31kDa，等电点为685。二级结构主要由α-螺旋（约44％）组成，β-折叠、转角结构和无规则卷曲分别约占20％。序列同源性分析显示，蒺藜苜蓿MtCYP450与豆科植物狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolus)和大豆(Glyctne max)中的CYP94亚家族氨基酸序列同源性较高，依次为75.7％和739％。因此，MtCYP450属于细胞色素P450的CYP94亚家族。
　　2、分析MtCYP450在蒺藜苜蓿不同组织中的表达量及对胁迫处理的反应。荧光定量PCR结果显示MtCYP450在苜蓿根、茎、叶、花和果荚中均有表达，其中叶片中表达量最高，根中最低，仅为叶片的12％。在胁迫处理（200mM NaCl、5％PEG、100μM ABA和100μM MeJA）后，叶片中MtCYP450基因表达量显著上升。因此，蒺藜苜蓿MtCYP450受以上胁迫诱导表达。
　　3、获得耐盐性增强的超表达tCYP450拟南芥。构建超表达载体pBI121-tCYP450，转化拟南芥并获得8个阳性转基因株系。qRT-PCR证明转基因株系中外源MtCYP450在拟南芥中成功转录。T2代超表达MtCYP450拟南芥在NaCl和PEG处理后MtCYP450表达量均上升。对转MtCYP50拟南芥的生长情况分析显示转基因拟南芥在NaCl(125mM)处理后根长是野生型的163倍，表明MtCYP450增强了拟南芥根系的耐盐性。
　　4、分别获得了超表达和敲除MtCYP450基因的转基因苜蓿。将表达载体pBI121-MtCYP450转化蒺藜苜蓿，通过基因组水平和转录水平鉴定获得32个超表达M4tCYP50蒺藜苜蓿株系。同时，利用CRISPR/Cas9技术，构建基因敲除表达载体pRGEB31-MtCYP450并转化蒺藜苜蓿。测序结果表明已获得12个MtCYP450基因敲除的突变植株株系。该材料将用于蒺藜苜蓿MtCYP50基因耐盐性研究。

目录

声明

摘要

英文略缩表

第一章 引言

1．1 植物细胞色素P450研究进展

1．1．1 细胞色素P450基因家族的起源与分类

1．1．2 植物细胞色素P450的结构特点

1．1．3 植物细胞色素P450的分布

1．1．4 植物细胞色素P4so基因的功能研究

1．2 蒺藜苜蓿中细胞色素P450的研究概述

1．3 本研究目的意义

第二章 MtCYP450的克隆及生物信息学分析

2．1 材料与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 R108生态型蒺藜苜蓿的培养

2．2．2 植物基因组DNA的提取

2．2．3 MtCYP450基因的克隆

2．2．4 PCR产物的回收

2．2．5 连接克隆载体及转化大肠杆菌

2．2．6 生物信息学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 目的基因的克隆

2．3．2 生物信息学分析

2．3．3 启动子顺式作用元件预测分析

2．4 讨论

第三章 MtCYP450的表达特性分析

3．1 材料与试剂

3．2 实验方法

3．2．1 MtCYP450基因在苜蓿中的表达模式分析

3．2．2 原核表达分析

3．3 结果分析

3．3．1 组织差异性表达分析

3．3．2 不同诱导条件下的表达分析

3．3．3 原核表达分析

3．4 讨论

第四章 MtCYP450对拟南芥的遗传转化

4．1 材料与试剂

4．1．1 实验材料与试剂

4．2．2 农杆菌EHA105的转化和鉴定

4．2．3 对拟南芥的遗传转化

4．2．4 转基因拟南芥的阳性鉴定

4．3．1 超表达载体的构建及鉴定

4．3．2 转基因拟南芥鉴定

4．3．3 转基因拟南芥中MtCYP450基因的表达分析

4．3．4 转基因拟南芥的抗逆性分析

4．4 讨论

第五章 MtCYP450对蒺藜苜蓿的遗传转化

5．2．2 CRISPR／Cas9介导的基因敲除载体的构建

5．2．3 蒺藜首蓿的遗传转化

5．2．4 转基因株系的阳性鉴定

5．3 结果分析

5．3．1 转基因蒺藜苜蓿的获得及鉴定

5．3．2 超表达转基因植株的鉴定

5．3．3 CRISPR／Cas9介导的基因敲出载体转基因的鉴定

5．4 讨论

6．1 结论

6．2 后续工作及展望

参考文献

致谢

作者简历